比较转录组学揭示沙眼衣原体应对不同胁迫的共同诱导基因

《Infection and Immunity》：Comparative transcriptomics reveals genes commonly induced by distinct stressors in Chlamydia

作为领域内一项系统性的整合分析，本研究通过重新分析五种不同胁迫条件下的已发表RNA测序数据，首次全面比较了沙眼衣原体（C. trachomatis）在应对长期慢性胁迫（如γ干扰素（IFNγ）、色氨酸饥饿、铁饥饿、青霉素暴露）与急性胁迫（热休克）时的转录重编程差异与共性。分析表明，不同的生物胁迫驱动了各自特异的转录程序，但同时存在一组跨胁迫条件一致调控的基因，可能代表了破坏衣原体持续性感染状态的潜在治疗靶点。

　　

比较转录组学揭示沙眼衣原体应对不同胁迫的共同诱导基因

研究团队对已发表的五组高质量沙眼衣原体RNA测序数据集进行了比较性再分析，这些数据集分别来源于经长期γ干扰素处理、色氨酸饥饿、铁饥饿、青霉素暴露或急性热休克处理的细胞培养物。这些研究为理解这一专性细胞内致病菌在应对宿主免疫攻击和不利环境时的生存策略提供了系统性的新见解。

应激转录组研究具有极高的测序深度

为了确保研究的可比性，研究者采用统一的生物信息学流程和工具重新处理了所有原始测序数据。这五个数据集均达到了极高的测序深度，基因组覆盖度范围从近250倍到超过8,000倍不等。如此高的覆盖度为严谨地比较衣原体在不同胁迫条件下的转录组响应提供了坚实的数据基础。

应激响应中存在广泛的转录组重编程

沙眼衣原体基因组编码超过900个蛋白质编码基因。分析发现，暴露于γ干扰素、色氨酸饥饿、铁饥饿、青霉素或热休克等条件下，显著改变了近三分之一的基因表达。在满足常用阈值（倍性变化≥1.5，P< 0.05）的情况下，差异表达基因的数量在292至363个之间。这一发现强化了沙眼衣原体在面对多种形式胁迫时会启动广泛的转录重编程这一观点。

急性热休克与慢性胁迫转录组的明显区分

研究者对五种胁迫条件下的转录变化进行了系列比较分析，并排除了沙眼血清型背景差异可能带来的混淆效应。通过构建667个在至少一种条件下差异表达基因的热图，发现色氨酸饥饿和铁饥饿形成了最接近的一对，反映了这两种营养饥饿对细菌产生的广泛相似影响。青霉素处理的样本则与这对紧密聚类。有趣的是，γ干扰素诱导的转录组与色氨酸饥饿转录组距离较远，这一分离出乎意料，因为γ干扰素暴露与宿主驱动的色氨酸饥饿之间存在公认的关联。热休克转录组最为独特，相对于四种慢性胁迫条件形成了一个明确分离的分支。

这一区别通过皮尔逊相关性分析得到了独立验证。分析再次显示色氨酸饥饿和铁饥饿之间存在最强的相关性。热休克与所有其他条件均呈负相关，进一步巩固了其独特的转录组特征。总之，层次聚类和相关性分析揭示了一个清晰的转录重编程模式：营养饥饿和青霉素诱导的转录组构成一个密切相关的组群，γ干扰素形成一个更独立的支系，而热休克则代表了最独特的条件。

急性和慢性胁迫对蛋白质合成及Ⅲ型分泌系统基因表达的相反效应

为了探究沙眼衣原体在不同胁迫条件下如何优先处理不同的生物过程，研究者将差异表达基因分配到功能类别中进行分析。在γ干扰素、色氨酸饥饿、铁饥饿和青霉素诱导的转录组中，“翻译与核糖体结构及生物发生”类别占上调基因的最大比例，达到23–37%。相反，在慢性胁迫转录组中，该类别对下调基因的贡献仅为3–7%，但在热休克条件下却占所有下调基因的25%。这表明，翻译和核糖体相关基因在慢性胁迫期间被优先上调，而在急性热休克期间则被下调。

与此相对的模式出现在Ⅲ型分泌系统基因类别中。在四种慢性胁迫条件下，T3SS基因仅占上调基因的1–3%，但构成了下调基因的18–22%。多个编码T3SS结构组分、伴侣蛋白或效应蛋白的基因在所有四种慢性胁迫转录组中均下调。此前研究已表明这些基因在网状体向原体分化的过程中会上调。慢性胁迫期间T3SS基因的主要下调与持续性状态相一致，在这种状态下，网状体向原体的分化以及晚期发育基因的表达受到抑制。相比之下，45°C的热休克上调了其总上调基因中11%的T3SS类别基因，而该类别在其下调基因中仅占2%。这表明，在极端胁迫条件下，晚期发育过程中通常诱导的T3SS效应蛋白可能有助于细胞内衣原体的存活。

胁迫特异性转录组间的差异

研究者进一步通过计算每个功能类别中上调或下调基因的比例，并显示为分叉条形图，对基于差异表达基因数量的分析进行了补充。这种类别归一化的方法证实了上述翻译、核糖体相关基因与T3SS基因之间的相反行为，并进一步将急性热休克转录组与慢性胁迫诱导的转录组区分开来。

三个功能类别的表现尤其突出。在慢性胁迫转录组中，“能量产生与转换”类别的基因表现出轻微的上调比例和较大的下调比例，而热休克转录组则显示出显著的上调比例，几乎没有对应的下调。这种相反的模式与慢性胁迫下生长和代谢活动降低导致细胞能量需求减少相一致，而急性热休克下的生存则需要增强能量产生以支持胁迫耐受和恢复。

“细胞壁、膜或包膜生物发生”类别的基因在所有四种慢性胁迫转录组中都表现出持续较大的下调比例和极小的上调比例，而热休克转录组则表现出明显的上调比例和几乎无下调。许多在慢性胁迫下下调的基因是倾向于在原体中表达的。值得注意的是，编码原体外膜复合物主要组分的omcA和omcB基因在所有四种慢性胁迫转录组中均下调，但在热休克期间上调。这一模式与慢性胁迫期间抑制与原体相关的包膜生物合成相符，反映了在诱导持续性状态的条件下抑制了网状体向原体的分化。相比之下，omcA和omcB在急性热休克期间的上调是出乎意料的，可能反映了一种独特的应激反应，可能利用原体包膜组分来帮助维持极端条件下的衣原体细胞完整性。

此外，分比例分析揭示了几个功能类别中显著的胁迫特异性调控模式。例如，“无机离子转运与代谢”在色氨酸饥饿期间表现出显著的上调，在γ干扰素处理中次之，但在铁饥饿或青霉素暴露下反应甚微。相反，tRNA基因在慢性胁迫中表现出高度可变的上调，在青霉素处理期间强烈诱导，但在铁饥饿下变化最小。这些模式强调，除了共同特征外，每种胁迫条件都会引发独特的转录反应，而非单一的慢性胁迫程序。

不同胁迫转录组中转录调节因子基因的表达模式

为了探究转录调控如何影响五种胁迫转录组的构成，研究者分析了在至少一种条件下差异表达的转录调节因子基因的表达模式。基于调节因子表达谱的聚类与全局转录组的聚类高度一致，再次强化了急性热休克反应与四种慢性胁迫反应之间的明确分离。

一个独特的热休克相关聚类包含了对热休克有强烈且选择性诱导的调节因子，其中包括热诱导伴侣蛋白基因的阻遏蛋白hrcA，以及最近发现的hrcA的热响应拮抗剂hagF。这些调节因子共同定义了一个以蛋白质质量控制为特征的、协调的热休克特异性转录状态。

相反，一个慢性胁迫相关聚类则由优先在部分慢性胁迫条件下（相对于热休克）上调的调节因子定义。该组包括晚期发育基因表达的阻遏蛋白euo，以及营养响应调节因子，如trpR和ytgR。这些模式与持续性诱导胁迫期间持续的代谢限制和晚期发育程序的抑制相一致。

除了这些广泛的聚类之外，几个转录调节因子在不同的慢性胁迫条件下显示出胁迫特异性或异质性的表达模式。核心σ因子基因rpoD、rpoN和fliA在慢性胁迫间的调控方式各异，而非统一调控。这种差异调控可能解释了尽管γ干扰素和色氨酸饥饿对氨基酸可用性有共同影响，但它们的转录组却存在部分差异的特征。

五种胁迫转录组中普遍受调控的基因

尽管存在上述广泛的胁迫特异性转录差异，研究也探索了是否有基因在多种胁迫转录组中被一致调控。使用维恩图比较发现，四种慢性胁迫转录组共有20个上调基因和99个下调基因。当将热休克转录组纳入比较时，共同上调和共同下调的基因数量分别减少到4个。

在所有五种胁迫转录组中共同上调的四个基因中，atpC、hisS、incE和ctl0473/ct221分别编码ATP合酶亚基、组氨酰-tRNA合成酶、包涵体膜蛋白E和一个假定蛋白。在所有五种胁迫转录组中共同下调的四个基因中，ompA和ctl0220/ct848分别编码主要外膜蛋白和一个T3SS效应蛋白；其余两个基因ctl0174/ct805和ctl0430/ct178编码假定蛋白。这些基因在所有胁迫条件下的一致调控表明它们参与了应激反应，要么作为适应过程的主动驱动者，要么作为共享生理状态的被动标记。

总结与展望

总之，这项比较分析表明，沙眼衣原体适应不同生物胁迫是由不同的转录组重编程驱动的，但同时始终涉及一组共同受调控的基因。这些基因的产物可能代表了跨持续性诱导环境的共同脆弱点。例如，细菌tRNA合成酶（如HisS）和ATP合酶（如AtpC）在其他细菌系统中已被验证为抗菌靶点。靶向在多种胁迫诱导的转录状态中持续上调并发挥重要功能的相关基因，可能代表了一种破坏衣原体持续性感染的可行策略。

然而，研究也存在一定的局限性。整合分析的数据集在沙眼衣原体血清型背景、宿主细胞类型以及原始实验设计的其他参数上存在差异。虽然通过将跨条件比较限制在血清型D和L2共享的基因，并基于相对于匹配对照条件的胁迫诱导转录变化（而非绝对表达水平）来缓解这些异质性来源，但仍无法评估血清型特异性基因对胁迫适应和持续性的潜在贡献。尽管如此，尽管存在这些差异，慢性胁迫转录组之间仍出现了连贯的相关性，这支持了观察到的相似性反映了共享的胁迫响应程序，而非实验设计的人为结果这一结论。这项工作对于未来开发靶向衣原体持续性感染的抗衣原体策略具有重要意义。