《Advanced Drug Delivery Reviews》：Matrix-integrated microfluidic tumor models for evaluating drug delivery systems and pre-clinical testing
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本文系统综述了整合细胞外基质（ECM）的“芯片上肿瘤”微流控平台在药物递送研究中的应用。作者阐述了如何利用这些系统模拟肿瘤微环境（TME）的关键特征（如ECM、血管、缺氧等），以更精准地评估纳米载体、生物制剂及细胞/基因疗法等的渗透、转运与疗效。文章强调了该技术在弥补传统体外模型与复杂体内研究之间差距方面的潜力，认为其有望加速药物递送系统的临床转化并推动个性化治疗策略的发展。
关键肿瘤微环境影响药物递送的特征
肿瘤微环境是一个由细胞、物理和生化成分共同构成的动态、相互关联的生态系统，它们协同调控治疗药物的转运、分布和最终效应。肿瘤细胞与基质细胞、免疫细胞相互作用，并嵌入在动态的细胞外基质中，接收生化与机械信号。这种异质性构成了治疗的内在耐药性屏障，限制了临床前发现向临床的转化。
细胞外基质（ECM）
ECM是提供细胞结构支持和生化信号的大分子网络，在TME中代表了药物递送的主要障碍。肿瘤ECM富含I型和III型原纤维胶原蛋白、蛋白聚糖、糖胺聚糖（GAGs，如透明质酸HA）、纤连蛋白和层粘连蛋白。过度的胶原沉积会形成致密、排列整齐且高度交联的网络，物理性地限制分子扩散，特别是对于抗体或纳米颗粒（NPs）等大分子药物，导致药物在血管周围区域被捕获，分布不均。这种结构改变减少了ECM的孔隙率和渗透性，限制了对流运输和分子扩散。此外，ECM的网格尺寸（纳米尺度网络交联点间的平均距离）减小，进一步限制了营养物质、氧气和治疗剂的扩散，影响药物生物利用度，并与细胞生存和耐药机制直接相关。透明质酸等形成的水化凝胶网络会增加间质液压（IFP），压迫血管，减少灌注。异常的纤连蛋白和层粘连蛋白表达也增强了细胞-基质黏附。这些成分和结构的改变使基质硬化，导致肿瘤组织处于高应力状态，直接影响药物运输和疗效。基质硬化源于原纤维胶原蛋白的沉积与排列、基质纤维的酶促交联、细胞收缩力、持续的ECM重塑以及固体应力的积累。这些应力会降低灌注并损害药物向肿瘤核心区域的对流运输。此外，ECM硬化会激活癌症细胞和基质细胞中的机械转导通路（如整合素-FAK和YAP/TAZ信号传导），导致基因表达改变，促进上皮-间质转化（EMT）、细胞存活和耐药性。
肿瘤血管系统
肿瘤血管生成产生的是一个紊乱、异质性的血管网络，表现为管径不一、内皮不连续、基底膜破碎或增厚。这些异常产生了增强的通透性和滞留（EPR）效应，虽然可能促进纳米颗粒外渗，但也导致药物递送效率低下且不均一。血管的空间异质性进一步加剧了这个问题：外周区域通常血管丰富，而肿瘤核心可能几乎无血管，导致系统性给药易于在肿瘤外围积累，但难以到达耐药细胞群驻留的内部区域。功能上，不规则的血管几何形状和完整性差会形成陡峭的氧气、营养物质和药物梯度，而受损的淋巴引流以及致密、僵硬的ECM会增加IFP，压迫血管，加剧低灌注，限制对流运输和药物向肿瘤组织的渗透。此外，功能失调的肿瘤血管还充当细胞运输的双向门户，阻碍抗肿瘤免疫细胞（如T细胞和NK细胞）向肿瘤核心的有效募集和浸润，同时也促进癌细胞进入体循环，发生转移。
间质流体压力（IFP）与剪切应力
致密交联的ECM、渗漏但受压的血管以及淋巴引流缺陷，深刻地改变了实体瘤中的流体输运，导致IFP升高和异常剪切应力。肿瘤内部的IFP可高达60 mmHg（正常组织为-1至5 mmHg），这种升高的压力在肿瘤内部相对均匀，但在边缘急剧下降，破坏了流体动力学并减少血管与间质区室间的分子交换。主要的驱动因素是未成熟、高通透性血管的过度血浆渗漏以及功能性淋巴引流的缺乏，这消除了正常的过滤-引流平衡，迫使药物和纳米颗粒的运输主要依赖于缓慢且低效的扩散过程。因此，药物倾向于在血管周围和外周区域积聚，难以到达肿瘤核心，即所谓的“边缘效应”。IFP和固体应力的共同作用会压迫肿瘤内血管，严重限制大分子药物和纳米颗粒的递送。此外，流体剪切应力也显著影响运输和细胞行为。肿瘤血管不规则几何形状和间歇性血流产生的异质性剪切力，会破坏内皮连接、改变跨血管交换并调节药物摄取和肿瘤耐药性。
缺氧、酸中毒和氧化还原改变
实体瘤表现出明显的生化和代谢异质性，其中缺氧是治疗反应的关键决定因素。当快速增殖的癌细胞和基质细胞的耗氧量超过异常血管的有限供应时，就会发生缺氧。不同于健康组织，肿瘤在血管附近呈现常氧区域，并向肿瘤核心逐渐变为低氧甚至坏死区。缺氧诱导因子（HIF-1、HIF-2、HIF-3）调控这些适应性变化，通过血管内皮生长因子（VEGF）促进血管生成，但HIF驱动的血管仍然紊乱且渗漏，持续缺氧并导致治疗抵抗。从治疗角度看，缺氧的后果是多方面的。这种改变的氧动力学深刻地重塑了TME的氧化还原稳态。线粒体功能障碍和糖酵解增强产生异常的活性氧（ROS），而肿瘤细胞会上调抗氧化系统（如谷胱甘肽、硫氧还蛋白、NADPH），建立新的氧化还原平衡，使其能在氧化应激下生存。这种氧化还原失衡延伸到免疫微环境，削弱细胞毒性T细胞功能，增强调节性T细胞活性，降低对免疫检查点抑制剂的反应性。此外，由此产生的缺氧和氧化环境限制了ROS依赖性疗法（如放疗和光动力疗法）的疗效，并通过改变转运蛋白表达促进多药耐药。灌注异质性进一步产生葡萄糖和代谢副产物（如腺苷和乳酸）梯度，导致细胞外酸中毒。有限的氧气和营养输送迫使癌细胞依赖糖酵解，产生过量的乳酸和质子，使细胞外pH降至6.5–6.8，而细胞内pH维持在7.4左右，形成了与缺氧区域重叠的pH梯度。酸性条件会减少弱碱性化疗药物的摄取，激活外排泵（如P-糖蛋白），并导致多药耐药。酸中毒还会重塑肿瘤免疫景观，抑制细胞毒性T细胞和NK细胞，同时促进M2巨噬细胞和促肿瘤中性粒细胞、树突状细胞，损害肿瘤免疫监视并降低免疫疗法（包括免疫检查点抑制剂）的疗效。
基质细胞与免疫细胞的贡献
基质细胞和免疫细胞在塑造TME、建立限制药物递送和疗效的物理和生化约束方面发挥着积极作用。在基质细胞中，活化的癌症相关成纤维细胞（CAFs）分泌丰富的ECM成分（胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白）以及交联酶（如LOX），改变肿瘤ECM的机械和结构性质。同时，CAFs释放细胞因子和生长因子（如TGF-β、PDGF），维持成纤维细胞活化、促进异常血管生成、重编程代谢和氧化还原环境，以利于肿瘤细胞存活、增殖和治疗抵抗。这些生化和结构改变共同损害药物运输：致密的ECM沉积和交联限制扩散，而CAF产生的收缩力压迫肿瘤内血管，加剧灌注不足。此外，CAF来源的可溶性因子调节内皮通透性并影响药物在血管周围空间的分布，并且某些CAF亚群甚至可以代谢或隔离治疗剂，降低其生物利用度和空间渗透效果。这些效应延伸到阻碍纳米颗粒外渗以及限制抗体-药物偶联物和脂质体制剂的渗透。
免疫细胞与这些基质成分协同作用，进一步调节药物递送和疗效。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）分泌细胞因子（如IL-10、VEGF），维持血管生成和血管功能障碍，强化了CAFs建立的相同屏障。它们还会内化或代谢治疗化合物（包括纳米颗粒和抗体-药物偶联物），限制其分布和肿瘤内积累。髓源性抑制细胞（MDSCs）和调节性T细胞通过释放抑制性细胞因子来抑制细胞毒性淋巴细胞活性，并与CAFs相互作用，影响ECM重塑、血管通透性和IFP。额外的髓系群体（如中性粒细胞和树突状细胞）释放蛋白酶和生长因子，进一步重塑ECM并改变局部血管和化学条件，产生治疗抵抗生态位。在治疗上，针对这些细胞成分的策略显示出克服TME所施加屏障的前景。对CAFs进行重编程或耗竭的策略可以减少ECM硬度、解除血管压迫并改善化疗药物和纳米颗粒在促纤维化肿瘤中的渗透。同样，通过集落刺激因子1受体（CSF1R）抑制或促炎表型极化来调节TAM活性，可以正常化血管、限制药物隔离，并增强化疗和免疫疗法的疗效。
传统策略
传统的体外癌症模型长期依赖于2D细胞培养，即肿瘤细胞以单层形式生长。虽然这些系统简单、经济、高度可重复，但即使使用胶原蛋白、纤连蛋白或层粘连蛋白等ECM成分进行表面包被，2D模型也无法再现天然肿瘤组织的三维结构、组织方式以及复杂的细胞-细胞和细胞-基质相互作用。因此，其在预测实体瘤中药物递送和疗效方面的转化价值有限。
为部分解决这些限制，人们开发了3D培养模型，允许肿瘤细胞在ECM样基质中作为多细胞团簇生长。在这个背景下，球体通常指来源于永生化细胞系的简单3D聚集体，而类器官则指来源于干细胞或原代细胞的自组织多细胞结构，能够再现起源组织的关键结构和功能特征。支架依赖的3D培养将细胞包埋于基质中，通常在传统的培养形式（如孔板或Transwell小室）中进行。这些基质提供了结构支持和生化线索，影响肿瘤生长、侵袭和药物反应。虽然这些方法相较于2D培养提供了改进的生理相关性，但它们通常难以精确控制基质特性、空间组织和动态环境参数（如流体流动或梯度形成），这些限制促使了向微型化和微工程培养系统的过渡。微流体肿瘤芯片平台通过将球体或类器官包埋于模拟基质的基质中，并使其受控于灌注和间质流等生化和生物物理线索，为克服这些问题提供了工具。
用于肿瘤建模的微流控平台
微流体肿瘤芯片平台已成为补充性系统，能够在三维微环境中可控地集成细胞和非细胞成分，在生理相关条件下促进对药物转运、分布和细胞反应的研究。
肿瘤芯片系统中的细胞外基质
肿瘤芯片系统的一个关键组成部分是细胞结构支撑，旨在模拟天然的ECM。该基质通常使用天然或合成成分工程化的生物材料来包埋细胞。天然基质可以进一步分为i)纯化的ECM成分（如胶原蛋白、纤维蛋白原、壳聚糖、海藻酸、透明质酸）；ii)其他天然ECM基水凝胶（如明胶甲基丙烯酰（GelMA）、白蛋白、蛋清）；以及iii)直接来源于天然ECM的材料（如商业来源的Matrigel?或基底膜提取物（BME））。此外，通过脱细胞从天然组织获得的脱细胞ECM（dECM）或细胞分泌基质，提供了保留生化复杂性和组织特异性线索的生理相关支架。dECM水凝胶可定制以复制不同的TME，如肝脏、肺或乳腺癌。作为天然水凝胶的替代方案，合成材料（如PEG、PHEMA、PVA）也经常用于制造肿瘤芯片模型，特别是在需要机械强度、可重复性和可调物理化学特性时。近年来，表面生物功能化策略被开发以解决合成材料固有的局限性，例如其有限的生物活性和支持组织特异性细胞功能的能力不足。整合素结合RGD肽、基质金属蛋白酶、生长因子或特定生物分子（如胶原蛋白、HA、纤连蛋白或层粘连蛋白片段）的结合，增强了细胞粘附、增殖和分化，使合成基质更接近天然ECM的生物学性能。
在实际应用中，肿瘤芯片平台中经常使用混合水凝胶，因为它们整合了每种材料的互补生化和机械特性。这些系统通常将天然材料与合成材料相结合，产生具有改进机械强度、稳定性和生物活性的可调支架。除了这些混合系统外，天然-天然复合材料以及包含dECM组分或生物活性颗粒（二氧化硅、羟基磷灰石或氧化石墨烯）的多组分水凝胶也已出现。它们能够精细调节微通道内的机械特性和生化梯度，这对于需要组织特定硬度的肿瘤模型尤其有价值。
肿瘤芯片系统中的细胞培养
在微流控平台内，肿瘤模型可以从单一细胞类型系统到多细胞共培养，具体取决于要捕获的生物学相互作用水平。如今，单培养仍然是微流控装置内肿瘤建模最直接的方法。其简单性有助于实验可重复性，并允许对肿瘤内在过程（如增殖、迁移和对化疗药物的反应）进行受控研究。然而，单培养的主要局限性在于缺乏基质和免疫成分，而这些成分是体内药物递送和耐药性的关键决定因素。因此，其转化预测能力仍然有限。相比之下，微流控中的共培养系统通过在同一微环境中将癌细胞与基质成纤维细胞、内皮细胞或免疫细胞亚群相结合，引入了额外的生物学复杂性。这种配置能够模拟细胞间相互作用（如肿瘤-基质串扰、血管生成和免疫逃逸），而这些是药物递送和治疗效果的核心。共培养方法既可以通过分散的单细胞群体实现，也可以通过多细胞团簇（如球体或类器官）实现，从而评估异型细胞相互作用如何影响药物渗透、代谢和耐药性。
重要的是，这些微流控方法并不取代已建立的体外培养策略，而是将其整合到一个微流控框架中，以实现增强的空间组织、动态调节和生理相关性。三维肿瘤结构，包括类球体或类器官的组装体，可以通过将单个细胞包埋在水凝胶基质中在原位生成，允许细胞在定义的生物力学和生化约束下自我组织成多细胞团簇。或者，它们也可以在外部培养形成预组装的团簇，然后引入设备中。这些方法适用于单培养和多细胞系共培养，允许对空间组织和细胞相互作用进行微调控制。当这些细胞结构在这种微环境中培养时，它们受益于受控的营养和氧气输送、动态流体流动，以及整合血管或免疫区室的可能性。这克服了传统静态细胞团簇的一些限制，并实现了更具预测性的药物筛选和机理研究。将复杂性再向前推进一步，多器官模型也被制造为人体芯片平台。这些模型能够模拟跨互连组织的吸收、分布、代谢、排泄或毒性（ADME-Tox）过程。这些系统可以在动态、人类相关的环境中评估治疗分布和非靶向效应。
肿瘤芯片系统中的血管系统建模
与静态或无灌注的3D培养不同，血管化微流控模型能够实时分析灌注和屏障完整性，为评估跨内皮界面的药物递送效率和纳米颗粒运输提供了强大的平台。这些系统相较于传统2D内皮单层的关键优势在于，它们能够再现剪切应力依赖性内皮成熟和紧密屏障功能，而这对于药物外渗和免疫细胞运输的生理相关预测至关重要。有两种主要策略常用于将血液血管系统整合到微流控肿瘤模型中：基于发芽血管生成的模型和基于血管生成的自组装模型。在发芽血管生成模型中，内皮细胞首先建立灌注血管或单层，然后响应血管生成信号向邻近的水凝胶基质延伸出芽。这些系统特别适合研究内皮出芽动力学、定向迁移和肿瘤诱导的血管生成信号传导。相比之下，基于血管生成的模型依赖于内皮细胞与基质细胞在3D水凝胶基质中共培养时，内皮细胞的自发组织形成相互连接的毛细管样网络。这种方法密切模拟体内观察到的血管生成和血管生成的动态过程，允许研究管腔形成和肿瘤诱导的血管重塑。由此产生的微血管系统通常表现出生理屏障特性，包括选择性通透性和剪切依赖性成熟，使其非常适合外渗或免疫细胞浸润的研究。或者，图案化微通道技术依赖于定义血管几何形状的制造。这些方法能够精确控制血管尺寸、分支和流动方向性，这些是研究运输动力学和药物梯度的基本参数。最近的进展越来越多地结合这两种方法，将自组装微血管集成到工程化的通道结构中，以将生物学真实性与结构精度结合起来。
肿瘤芯片系统中的生物物理和生化刺激
为了忠实地再现复杂的TME，肿瘤芯片平台经常整合各种生物物理和生化刺激，模拟体内存在的动态条件。这些刺激包括受控的流体流动和剪切应力，以模拟血流和间质流。机械压缩和拉伸应变被应用于模拟与实体瘤生长相关的固体应力。生化梯度，如氧气、营养物质、生长因子和药物的浓度梯度，可以通过微流控设计来建立和维持，以研究缺氧、酸中毒和代谢异质性。此外，还可以施加电刺激来模拟神经支配对肿瘤行为的影响。通过整合这些刺激，肿瘤芯片模型提供了一个多方面的平台，不仅模拟了TME的结构成分，还模拟了其动态和机械方面，从而更全面、更生理相关地对药物递送和治疗反应进行建模。
