剂量不足的头孢他啶-阿维巴坦暴露驱动连续性blaKPC突变与宿主内共存多种变异肺炎克雷伯菌导致持续感染

《Microbiology Spectrum》：Suboptimal ceftazidime-avibactam exposure drives sequential blaKPC mutations and intra-host coexistence of Klebsiella pneumoniae harboring distinct variants leading to persistent infection

本研究通过分析一例肾功能不全患者接受减量头孢他啶-阿维巴坦(CAZ-AVI)与碳青霉烯类治疗期间，连续分离的10株表型交替的肺炎克雷伯菌(K. pneumoniae)，揭示了药物亚浓度暴露驱动blaKPC基因发生从KPC-2到KPC-33(D179Y)再到KPC-145(D179Y, T264A)的逐步累积性突变，并导致宿主内同时共存携带不同KPC亚型的细菌亚群，是造成感染难以根除、持续存在的重要原因。

　　

临床背景与问题重要性

产KPC（肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶）的肺炎克雷伯菌感染是全球日益严重的健康威胁。β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂复方制剂，如头孢他啶-阿维巴坦(CAZ-AVI)，是治疗此类感染的重要选择。然而，CAZ-AVI的使用会带来选择性压力，导致编码KPC酶的bla_KPC基因发生突变，产生多种变异体。这些变异体通常导致对CAZ-AVI耐药，却可能恢复对某些碳青霉烯类药物的敏感性，形成耐药表型的动态切换，为临床抗感染治疗带来巨大挑战。治疗期间bla_KPC突变的驱动因素及其对感染持续性的影响尚不完全清楚。

患者病程与菌株分离

本研究报道了一例慢性阻塞性肺疾病急性加重的患者，在长达122天的住院期间，从其痰标本中反复分离到10株非重复的肺炎克雷伯菌临床分离株。这些连续分离的菌株对抗菌药物的敏感性呈现交替变化：一些菌株对亚胺培南耐药但对CAZ-AVI敏感（亚胺培南最低抑菌浓度MIC为64 mg/L，CAZ-AVI MIC为1–4 mg/L），而另一些则对亚胺培南敏感但对CAZ-AVI耐药（亚胺培南MIC为0.25–1 mg/L，CAZ-AVI MIC ≥64 mg/L）。

菌株的遗传与表型特征

全基因组测序分析显示，所有10株分离株均属于同一克隆系ST11-KL64，基因组高度相似。然而，它们携带了四种不同的bla_KPC等位基因：bla_KPC-2、bla_KPC-33、bla_KPC-71和bla_KPC-145。基因型与表型高度相关：携带bla_KPC-2的菌株（KPN3， KPN7， KPN19， KPN22）表现为亚胺培南耐药/CAZ-AVI敏感；而携带变异体bla_KPC-33（KPN2， KPN6）、bla_KPC-71（KPN4）和bla_KPC-145（KPN11， KPN20， KPN25）的菌株则表现为亚胺培南敏感/CAZ-AVI耐药。质粒转化和克隆功能验证实验证实，bla_KPC-2是介导碳青霉烯类耐药的关键决定因子，而三个变异体则是介导CAZ-AVI耐药的关键决定因子。

bla_KPC在治疗期间的动态演变

通过追踪菌株分离时间与抗菌药物使用时间的关系，研究发现了7次连续的bla_KPC突变事件。一个关键模式是：从bla_KPC-2突变至变异体等位基因（如KPC-33， KPC-145）的事件，总是发生在患者暴露于CAZ-AVI治疗后的5至22天；而变异体回复突变为bla_KPC-2的事件，则发生在后续使用美罗培南或亚胺培南治疗后的6至21天。序列比对揭示了一个可能的逐步累积突变路径：bla_KPC-33相较于bla_KPC-2有一个单核苷酸变化（c.G537T， 导致D179Y），而bla_KPC-145则在bla_KPC-33的基础上增加了另一个突变（c.A792G， 导致T264A）。功能实验表明，KPC-145比KPC-33介导了更高水平的CAZ-AVI耐药。分子对接分析预测，与KPC-2相比，阿维巴坦与这三个变异体的结合模式和相互作用残基发生了改变，这从结构上解释了抑制剂活性降低的原因。

一个需要特别关注的背景是，由于患者存在肾功能损害，整个治疗过程中使用的CAZ-AVI和碳青霉烯类药物均为减量剂量。时间-杀菌曲线实验显示，针对携带bla_KPC-2的菌株，4倍和2倍MIC的CAZ-AVI能达到杀菌效果，但1倍MIC仅能造成初始杀灭后细菌再生长，而亚MIC水平只能抑制生长而无杀菌活性。这表明亚治疗浓度的CAZ-AVI未能彻底清除细菌，可能为耐药变异体的选择提供了空间。

宿主内不同KPC变异体菌株的共存

回顾性分析发现，在住院第85天，从同一份痰标本中报告了两种不同耐药表型的肺炎克雷伯菌分离株（KPN19和KPN20），基因分析证实它们分别携带bla_KPC-2和blaKPC-145。为了探究是否存在宿主内菌株亚群共存，研究者复苏了一份存档痰标本，并从中分离出三种形态不同的菌落：一种为主要的非粘液型小菌落，另两种为粘液型菌落（其中一种拉丝试验阳性）。药敏试验显示其耐药表型各异，分子分析证实它们分别携带bla_KPC-2和bla_KPC-145。这一发现表明，在治疗期间，宿主内确实同时存在携带不同bla_KPC亚型的肺炎克雷伯菌亚群，这种异质性在常规微生物学检查中可能因为优势菌落的掩盖而被漏检。

讨论与启示

本研究揭示了在减量CAZ-AVI和碳青霉烯类药物的压力下，bla_KPC-2可发生逐步累积性突变，产生对CAZ-AVI耐药性不断增强的变异体（如KPC-33， KPC-145），并且不同变异体菌株可在宿主内共存，共同导致了感染的持续不愈。这凸显了优化给药方案、确保充足药物暴露对于防止耐药性进化的重要性。对于这类感染的治疗，研究中的体外药敏数据显示，美罗培南-韦博巴坦(meropenem-vaborbactam)、亚胺培南-瑞来巴坦(imipenem-relebactam)和氨曲南-阿维巴坦(aztreonam-avibactam)对携带KPC及其变异体的菌株均保持活性，可作为备选治疗选择。值得注意的是，在本病例中，经过8天的亚胺培南与CAZ-AVI联合治疗后，可逆性的bla_KPC突变未再被检测到，提示这种联合方案可能具有临床益处。

结论

本病例研究证实，亚治疗浓度的头孢他啶-阿维巴坦暴露可能促进bla_KPC-2发生连续性突变，并导致携带不同KPC变异体的肺炎克雷伯菌亚群在宿主内共存，从而驱动持续性感染。这些发现强调了对产KPC/KPC变异体菌株感染，需要制定个体化的治疗方案、优化剂量和联合策略，以限制治疗期间耐药性的出现和持续。