《Microbiology Spectrum》：An experimental approach to investigate extracellular vesicle-mediated transfer of lipids between fungal cells
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本研究通过亲脂性染料FM 1-43建立了一套实验系统，直接可视化和定量分析了真菌（以隐球菌为主要模型）胞外囊泡(EVs)介导的细胞间脂质交换。利用囊泡示踪、transwell共培养及纳米流式等技术，证明了脂质可通过EVs在同种及不同种真菌细胞间进行无接触转移，为解析真菌群体通讯机制提供了可操作的研究框架。
胞外囊泡是真菌种群通讯的关键介质，但其介导脂质交换的机制尚不明确。本研究开发并验证了一套实验系统，利用亲脂性染料FM 1-43直接可视化和定量分析了在隐球菌模型中由EVs介导的脂质交换。
真菌细胞FM 1-43染色
FM 1-43是一种带有苯乙烯基团的亲脂性染料，能结合活细胞的膜脂质，常用于追踪多种生物的内吞和胞吐作用。该染料不能穿过生物膜，但可逆地结合于脂双层的外叶，在水中无荧光，而整合入膜后荧光强烈。实验证实，FM 1-43能有效染色多种真菌（如新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、白色念珠菌(Candida albicans)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和巴西孢子丝菌(Sporothrix brasiliensis)）的膜性结构。染色形态多样，从胞内圆形、边界清晰的细胞器到分散的胞质结构均有。
无荚膜新型隐球菌经FM 1-43染色后产生荧光EVs
选用无荚膜隐球菌菌株Cap67进行实验，因其缺失荚膜这一分泌过程最终屏障。用不同浓度的FM 1-43染色后培养24小时，通过纳米流式细胞术分析，检测到荧光EVs的数量与染色浓度直接相关。对照组（无细胞培养基添加染料）的荧光纳米颗粒检测可忽略不计，表明Cap67菌株能产生被FM 1-43染色的EVs。使用标准菌株H99（有荚膜）进行对比，也能检测到荧光EVs，但数量少于无荚膜菌株，而荧光强度更高。这表明多糖荚膜可能是EVs输出的屏障，但并非荧光EVs生成的普遍抑制剂。
Cap67细胞FM 1-43染色上清可将荧光转移至受体细胞
收集FM 1-43染色的Cap67细胞上清，与未染色的无荚膜细胞共孵育1、6、24小时后进行共聚焦显微镜分析。6小时后，与完整上清孵育的受体细胞出现清晰的胞内细胞器染色；而与经超速离心去除EVs的上清孵育的细胞，荧光始终处于本底水平。24小时观察到类似但强度较弱的荧光信号。这提示EV相关的荧光可被未染色的Cap67细胞摄取。
活体Cap67染色细胞在transwell模型中将荧光转移至未染色受体细胞
建立了transwell模型，将FM 1-43染色的供体细胞置于上室，未染色的Cap67受体细胞置于下室，两者通过允许EVs通过（孔径0.4 μm）但不允许细胞接触的聚碳酸酯膜隔开。使用Cap67和H99菌株作为供体细胞，在37°C孵育不同时间后分析受体细胞。孵育6小时后，使用H99或Cap67作为供体的系统中均观察到类似直接染色的荧光细胞，且当Cap67作为供体时，荧光信号显著更强。24小时后这一现象更明显，确认了Cap67作为供体细胞的更高效率。流式细胞术定量分析进一步证实了这些观察。
脂质转移发生于不同真菌物种间，但在新型隐球菌供体-受体配对中效率更高
将transwell模型扩展至跨物种脂质转移。使用棒状隐球菌(Cryptococcus deuterogattii)和白色念珠菌作为供体，新型隐球菌Cap67作为受体。共聚焦图像显示，所有供体-受体组合均能检测到荧光转移，但新型隐球菌配对中的信号显著强于跨物种系统。此外，比较了野生型菌株与缺失膜结构相关基因（如新型隐球菌的翻转酶Apt1和棒状隐球菌的 scramblase Aim25）的突变体作为供体，结果发现这些蛋白的缺失并未损害脂质转移效率，或在棒状隐球菌中突变体转移效率更高。流式细胞术量化结果基本与显微观察一致。
新型隐球菌的脂质摄取是一个在不同温度下发生的主动过程
实验表明，直接胞内染色在4°C下无效，提示脂质转移不是被动过程，可能需要内吞机制。在transwell模型中使用H99供体和Cap67受体，分别在30°C和37°C下进行，并引入热灭活的Cap67细胞作为受体。孵育6小时后，两种温度下的活细胞均观察到脂质摄取，而死细胞则未观察到。24小时后，活细胞和死细胞均有大量荧光，但死细胞中的荧光模式高度弥散，与活细胞中清晰的点状模式形成对比。这表明隐球菌中的脂质转移是发生在30°C和37°C的主动过程。
受体细胞摄取脂质的高分辨率成像
通过最大投影模式进行高分辨率共聚焦成像分析。在transwell模型中，以FM 1-43染色的H99或KN99细胞作为供体，活Cap67细胞作为受体。高分辨率分析显示，受体细胞中脂质来源的荧光组织成大小和形态与EVs一致的结构。这支持了一个模型：供体细胞释放的EVs随后被受体细胞内化，并在其胞内环境中保持结构完整。
本研究建立了一个多用途的定量研究框架，用于探究真菌中EVs介导的脂质交换。结合荧光成像、transwell实验和流式细胞术，证明了真菌EVs可以在无直接细胞接触的情况下，在同种和不同物种间运输脂质。这些发现揭示了真菌通讯的一个新维度，可能有助于群体适应、生物膜形成和致病机制。
