《Animal Reproduction Science》：Comparing the cryoprotective effects of glycerol and DMSO, with or without Equex, on Asian elephant (
Elephas maximus) spermatozoa
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本研究比较了甘油和二甲基亚砜在冷冻扩展剂中的效果，结合表面活性剂Equex STM，评估其对亚洲象精子存活率、膜完整性和DNA的影响。结果显示，甘油处理能显著提高精子总活性和前向运动能力（P<0.001），且与Equex联用可增强精子膜完整性和顶体完整性（P<0.001）。建议在亚洲象精子冷冻中采用甘油和Equex组合的扩展剂以提高解冻后精子质量。
Cameron Negus | Anuchai Pinyopummin | Sittidet Mahasawangkul | Rebecca Hobbs | Roslyn Bathgate
悉尼大学悉尼兽医学院科学系，澳大利亚新南威尔士州悉尼2006
摘要
亚洲象精液的冷冻保存在保持精液质量和解冻后的生育能力方面仍然存在问题。本研究比较了渗透性冷冻保护剂甘油和二甲基亚砜（DMSO）在冷冻保护剂中的效果，同时使用了表面活性剂Equex STM糊剂，探讨了它们对亚洲象精子在冷冻和解冻过程中的影响。本研究使用了三头成熟公象的八次射精样本。精液用含有甘油或DMSO的Tris卵黄基保护剂稀释，并在液氮中通过吸管进行冷冻。在解冻后2小时内，评估了精子的运动能力、膜结构、顶体以及DNA参数，以评价各种冷冻保护剂的保护效果。结果显示，无论冷冻保护剂中是否含有Equex，用甘油冷冻的精子总运动能力和渐进运动能力均高于用DMSO稀释的精子。当存在Equex时，无论使用哪种冷冻保护剂，亚洲象精子的存活率和顶体完整性均更高（P<0.001）。尽管不同公象之间存在较大差异，但使用甘油和Equex的冷冻保护剂在解冻后2小时内仍能保持较高比例的DNA完整性（P<0.05）。总体而言，这些结果表明，应将含有甘油和Equex的Tris卵黄基冷冻保护剂纳入现有的亚洲象精液冷冻保存方案中，以获得最佳的解冻后精子质量，从而提高其受精潜力。
引言
由于圈养条件下亚洲象的自然受孕率较低，以及在不同机构之间运输繁殖动物进行自然交配所面临的物流困难（Faust等人，2006年；Wiese和Willis，2006年），圈养的亚洲象种群面临着自我延续的挑战。由于精子在长时间运输过程中的受精能力会减弱（Brown等人，2004年；Thongtip等人，2009年），因此人工授精（AI）受到地理限制。因此，开发可靠的亚洲象精子冷冻保存方案将有助于改善这一濒危物种的圈养繁殖管理策略。由于精子在冷冻和解冻过程中容易受到冷冻损伤，导致受精能力严重下降（Sa-Ardrit等人，2006年；Saragusty等人，2005年），因此利用冷冻-解冻后的亚洲象精子进行人工授精仍是一个研究重点。尽管多年来通过改进冷冻保护剂的成分和选择合适的冷冻保护剂对亚洲象精液的冷冻保存进行了大量研究（Imrat等人，2013年；Saragusty等人，2009年；Thongtip等人，2004年），但目前仍未能通过人工授精产生活体亚洲象幼崽。在冷冻和解冻过程中，精子会因冰晶形成而受到压力（Holt，2000a；Mazur，1984年），这是导致精子死亡的主要生物物理因素之一。冰晶的形成模式以及精子在这些过程中的存活情况取决于冷冻保护剂（CPA）的性质（Hammerstedt等人，1990年）。然而，矛盾的是，根据类型和浓度的不同，冷冻保护剂本身也可能对精子产生毒性作用（Fahy等人，1990年）。甘油是最常用的精子冷冻保护剂，也用于与其密切相关的非洲象（Hermes等人，2013年），但它对公象精子的生育能力有负面影响（Vidament等人，2005年）。为了寻找替代的渗透性冷冻保护剂，许多研究人员研究了二甲基亚砜（DMSO），因其分子量较低且具有快速渗透能力（Yu和Quinn，1994年）。研究表明，DMSO可以作为甘油的有效替代品，适用于兔子（Kashiwazaki等人，2006年）、犀牛（Stoops等人，2010年）和小鼠（Sztein等人，2001年）的精子。
另一种已被证明能改善解冻后精子质量的冷冻介质添加剂是Equex STM，其主要成分是十二烷基硫酸钠（SDS）。虽然SDS的保护机制尚不清楚，但据推测它能够促进保护性脂质在保护剂中的溶解，从而增强脂质与精子细胞膜表面的相互作用（Pursel等人，1978年）。尽管已有研究使用添加了Equex的冷冻保护剂成功冷冻亚洲象精子（Buranaamnuay等人，2013年），但直接评估Equex对该物种精子参数的具体影响的研究仍然有限。
本研究使用了一种基于Tris卵黄的保护剂，该保护剂先前已被证明对亚洲象精液的保存有效（Pinyopummin等人，2017年），目的是评估（1）冷冻保护剂甘油和DMSO的效果；（2）表面活性剂SDS（Equex糊剂）对亚洲象精子在冷冻和解冻过程中存活能力的影响。这些发现将有助于制定针对亚洲象的特定冷冻保存方案，从而促进利用人工授精技术在圈养繁殖设施中的基因传播和保存。
试剂和培养基
除非另有说明，本研究中使用的所有化学品均来自Sigma Chemical Company（美国密苏里州圣路易斯和澳大利亚悉尼的分公司）。
在以下实验中，使用了一种基于Tris的保护剂，该保护剂最初用于犬类精子的保存（Pe?a和Linde-Forsberg，2000年），并已证明对亚洲象精液的保存有效（Pinyopummin等人，2017年）。Tris保护剂由198.1 mM Tris-(羟甲基)氨基甲烷、66.6 mM柠檬酸一水合物和44.4 mM其他成分组成。
新鲜射精样本参数
在尝试收集10头成熟公象的精液样本后，共有3头公象的8次射精符合研究标准（新鲜总运动能力≥55%）。这些射精样本的新鲜精子参数总结在表1中。分别使用来自公象1、2和3的1次、2次和5次射精样本进行实验。
冷冻保护剂和Equex对解冻后精子质量的影响
观察到总精子运动能力（图1a）、精子运动指数（图1b）和存活率（图1c）存在显著差异（P<0.05）。
讨论
本研究结果表明，对于亚洲象精子而言，甘油是比DMSO更优的冷冻保护剂，且添加Equex有助于保持精子细胞膜和顶体的完整性。与DMSO相比，甘油在解冻后更能有效保持精子的运动能力。尽管本研究中报告的解冻后运动能力可能不足以实现成功的人工授精，但这些发现仍具有重要意义。
结论
本研究旨在深入了解各种冷冻保护剂和表面活性剂在亚洲象精子冷冻保存过程中的相互作用。结果表明，与DMSO相比，甘油对解冻后精子运动能力的保护作用更为显著。在冷冻保护剂中添加Equex可更好地保持精子细胞膜和顶体的完整性。
作者贡献声明
Anuchai Pinyopummin：撰写、审阅与编辑、资源准备、概念构思。
Cameron Negus：撰写、审阅与编辑、初稿撰写、方法设计、实验实施、数据分析、概念构思。
Rebecca Hobbs：撰写、审阅与编辑、监督。
Sittidet Mahasawangkul：撰写、审阅与编辑、资源准备、实验实施、概念构思。
Roslyn Bathgate：撰写、审阅与编辑、项目监督、资金争取。
利益冲突声明
作者声明没有利益冲突。
致谢
本研究得到了澳大利亚Taronga保护协会、墨尔本动物园和珀斯动物园的支持和资助。作者感谢泰国Lampang国家象研究所和澳大利亚珀斯动物园的工作人员及主管的许可，以及Kasetsart大学Kamphaeng Saen校区兽医医学院提供的实验室设施。
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