《mSystems》：Integrated multi-omics reveals coordinated Staphylococcus aureus metabolic, iron transport, and stress responses to human serum
INTRODUCTION
金黄色葡萄球菌（S. aureus）是一种重要的人类机会性病原体。作为共生菌，它可在高达30%的人群皮肤或鼻腔中定植，并可能转化为致命病原体。其血流感染年发病率超过10/10万人，死亡率高达30%，且对万古霉素等最后防线抗生素的耐药性广泛出现，加剧了感染严重性。
在血流感染中，专职吞噬细胞和非细胞免疫成分（如抗菌肽、免疫球蛋白、补体系统）会靶向清除入侵病原体。虽然血清不含免疫细胞，但它对血液入侵性细菌病原体而言仍是一个强大的杀菌环境。金黄色葡萄球菌进化出了多种防御机制来对抗此环境，包括干扰抗体功能以防被吞噬、降解补体成分、通过蛋白水解降解或修饰其表面电荷来灭活抗菌肽，以及重塑细胞壁肽聚糖组织和质膜心磷脂的丰度。宿主还可以通过螯合必需营养素（主要是铁、锌、锰等痕量金属）来施加营养免疫，以限制细菌生长。细菌病原体则进化出多种机制来规避营养免疫。
阐明金黄色葡萄球菌对血清来源压力（如营养限制和无细胞免疫因子）的代谢重编程，可以揭示其适应、存活和持续存在于血流中的基本代谢途径。这些见解可能有助于开发靶向抗菌策略和合理设计的干预措施，以减轻侵袭性和慢性金黄色葡萄球菌感染。
本研究基于先前对四种临床重要败血症病原体（包括金黄色葡萄球菌）暴露于人血清后的多组学分析工作，聚焦于五种临床相关克隆谱系（BPH2760、BPH2819、BPH2900、BPH2947、BPH2986）的金黄色葡萄球菌血清反应，旨在识别驱动菌种特异性适应血清的保守分子特征。为克服以往晚期整合方法分辨率不足的问题，本研究采用了来自mixOmics R包的DIABLO框架，这是一种稀疏的多块偏最小二乘法，旨在将所有组学数据集整合到单个多变量模型中，以识别跨组学相互作用，减少单独分析的统计负担，并保留金黄色葡萄球菌血清反应的整合生物学背景。
RESULTS
Coordinated transcriptomic, proteomic, and metabolomic adaptation of S. aureusto serum
对五种金黄色葡萄球菌临床分离株进行多组学分析，以寻找其对人类血清的共同分子反应。主成分分析应用于每个组学层面，结果显示血清暴露与RPMI暴露的金黄色葡萄球菌样本清晰分离。使用DIABLO将数据集整合到一个统一的金黄色葡萄球菌暴露于人血清的预测模型中。DIABLO使用PLS框架来模拟分子特征与表型结果之间的关系，通过整合多个组学数据集并应用特征选择，突出了最具区分力的变量子集。最终DIABLO模型使用了60个多组学特征，这些特征在第一个成分上最优地区分了血清与RPMI暴露。
协调的血清反应特征表现为跨组学层的高度相关潜在成分。从DIABLO模型获得的载荷值显示了个体变量的具体贡献，更高的绝对值标志着更强的判别力。通过计算所有成分和选定特征之间的相似性矩阵并将其可视化为网络，揭示了转录组、蛋白质组和代谢组层面之间的相互作用，特征按功能分组并显示正负相关性，表明了对血清的协调反应。DIABLO识别出的判别和相关特征中富集的金黄色葡萄球菌途径包括细胞壁生物合成、碳水化合物代谢、铁转运和宿主免疫防御。与这些途径相关的基因及其产物表现出强正相关性，包括：在细胞壁生物合成和脂质代谢中关键的glmS；参与碳水化合物代谢的gapdhB和sucA；促进铁摄取的sstD、scdA和isdB；以及分别支持氧化应激抵抗机制和免疫逃避的perR和sbi。相反，参与核苷酸代谢的基因与碳水化合物代谢基因和脂质呈负相关。
观察到的模式表明，金黄色葡萄球菌响应血清经历了显著的代谢适应，参与摄取和利用血清来源的氨基酸、碳水化合物、脂肪酸、核苷酸及其衍生物。分析特别揭示了血清暴露后金黄色葡萄球菌铁获取蛋白丰度的显著增加。在宿主环境中，细胞外铁是有限的，通常被转铁蛋白、乳铁蛋白和红细胞内的血红蛋白等高亲和力铁结合蛋白螯合。铁载体依赖性和非铁载体依赖性铁获取蛋白水平的升高，凸显了铁获取在金黄色葡萄球菌存活中的关键作用。多组学数据的整合揭示了支持代谢适应性的反应，使金黄色葡萄球菌能够在对抗内在血清压力的同时保持适应性。
Network and enrichment analyses reveal S. aureusshared and strain-specific responses to serum
对每个菌株的差异表达基因或蛋白质进行识别，并进行交集分析。在转录水平，有143个基因上调，65个基因下调以响应血清。在蛋白质组水平，有21个上调蛋白和17个下调蛋白。进行了通路富集分析，包括过表达分析和基因集富集分析，以降低数据复杂性并发现血清暴露时引发的富集通路。利用通路间共享基因子集的相似性，还进行了网络分析，以发现跨组学层富集通路之间的相互作用。与之前的DIABLO发现一致，过表达分析和基因集富集分析确定了四个不同的功能模块，包括碳水化合物代谢、核糖体相关通路、铁获取和核苷酸代谢。
碳水化合物代谢模块由糖酵解/糖异生途径以及其他碳水化合物处理途径组成。上调的碳水化合物转运蛋白基因支持各种糖类的利用。一旦被磷酸转移酶系统转运和磷酸化，碳水化合物被糖酵解处理并转化为中间产物，这些关键代谢物将糖酵解与核苷酸和脂质代谢连接起来，从而增强了金黄色葡萄球菌在血清中的代谢灵活性。与其他代谢模块相比，网络分析显示核糖体相关通路在很大程度上是孤立的，与更广泛的代谢网络没有直接连接。转录组分析表明血清暴露后核糖体生物合成受到抑制。这些发现表明蛋白质生物合成被下调，作为金黄色葡萄球菌对血清应激适应性反应的一部分。
在血清暴露诱导的蛋白质组变化中，铁获取和核苷酸代谢途径显示出最显著的变化。值得注意的是，铁转运蛋白的丰度显著增加，包括SirA、FhuC、SstC、SstD、HtsA、IsdB、IsdE和IsdI。此外，参与铁硫簇结合的蛋白ScdA和CntA水平升高，同时miaB下调，表明金黄色葡萄球菌在血清条件下启动了铁节约策略。因此，金黄色葡萄球菌协调增强铁摄取与调节铁掺入金属蛋白，以在血清暴露期间有效管理铁的可用性。
参与核苷酸代谢的蛋白质，特别是那些与肌苷一磷酸生物合成途径相关的蛋白质，在所有金黄色葡萄球菌分离株中显著增加。该途径是嘌呤核苷酸合成的核心，这些转变强调了铁稳态和核苷酸生物合成被金黄色葡萄球菌用作支持在血清中存活和生长的关键适应策略。
Experimental validation of predicted molecular signatures of S. aureusresponses to human serum
为确认多组学整合和通路富集分析的结果，评估了参与碳代谢、铁获取和氧化应激抵抗的基因的转座子突变体相对于其亲本野生型菌株在血清存在下的适应性。首先验证了五个血流分离株与实验室菌株JE2的遗传相关性，观察到金黄色葡萄球菌核心基因组的高度保守性。菌株JE2与临床分离株BPH2986亲缘关系最近。
DIABLO整合模型将gapdhB和sucA确定为对血清反应的关键贡献者，显示出最高的载荷值。破坏任一基因均导致细菌在血清中的适应性显著降低，表明它们在响应血清暴露中都发挥重要作用。
GapdhB是一种糖异生酶，SucA是三羧酸循环中的一种酶，代表了碳代谢途径中的不同节点。为测试这一点，比较了gapdhB和sucA转座子突变体与野生型菌株在190种不同碳源上的生长和呼吸表型。在测试的碳源中，甲基丙酮酸、α-D-葡萄糖、D-氨基葡萄糖和其他己糖显著增强了野生型和突变体的呼吸作用，而乙醛酸和衣康酸抑制了呼吸作用。值得注意的是，补充甲基丙酮酸部分挽救了sucA突变体的呼吸缺陷，超过了野生型水平，但未能将gapdhB突变体的活性恢复到野生型水平。补充甲基丙酮酸揭示了gapdhB和sucA在丙酮酸分解代谢中的不同作用。
为研究铁获取系统对金黄色葡萄球菌在血清中适应性的贡献，评估了四个破坏htsA、sirA、sstD和isdB基因的突变体。蛋白质组学显示血清暴露后HtsA、SirA、SstD和IsdB水平显著升高，表明它们在响应铁限制条件时上调。金黄色葡萄球菌sirA和sstD转座子突变体在血清中的适应性显著受损。相比之下，破坏htsA没有显著影响适应性。有趣的是，isdB突变体在商业来源的血清中没有表现出适应性缺陷，这可能是由于缺乏血红蛋白或血红素。这些发现强调了金黄色葡萄球菌铁获取系统在铁限制宿主环境中的环境依赖性利用，并突出了铁载体和儿茶酚介导的途径在支持葡萄球菌存活中的关键作用。
氧化应激是宿主免疫反应的基本组成部分。为对抗活性氧，细菌进化出了复杂的氧化应激反应机制。在金黄色葡萄球菌中，PerR作为主要的过氧化物传感器。在我们的分析中，PerR作为金黄色葡萄球菌氧化应激抵抗的关键分子决定因素出现，这一发现通过实验测试得到证实。perR突变体在补充了0.25和0.5 mM过氧化氢的血清中表现出显著的适应性缺陷。血清暴露还引发了金黄色葡萄球菌色素（由crt操纵子编码，其产生受PerR控制）的显著产生。这些结果强调了PerR在促进金黄色葡萄球菌在血清中遇到的氧化应激条件下存活的关键作用，凸显了其在维持细菌在富含活性氧的宿主环境中的适应性方面的重要性。
Integrated metabolic responses of S. aureusto human serum
为概念化金黄色葡萄球菌响应血清的代谢动态重塑，基于文献构建了一个支架式代谢网络。该网络叠加了通过单组学分析和DIABLO整合结合网络分析识别的关键酶（上调基因标为橙色，下调基因标为浅蓝色）和特征分子的显著变化。这种整合方法揭示了金黄色葡萄球菌对血清环境挑战（特别是利用包括碳水化合物、氨基酸和脂质在内的多种碳源）启动了广泛且适应性强的代谢反应。
碳水化合物代谢围绕三个关键代谢节点组织，即葡萄糖-6-磷酸/果糖-6-磷酸、甘油醛-3-磷酸/二羟丙酮磷酸和丙酮酸，这些节点是营养同化的汇聚点。血清中碳水化合物转运蛋白基因的上调与我们的发现一致，即己糖单糖和二糖显著增强了金黄色葡萄球菌的代谢活性。值得注意的是，转录组数据支持这一点，揭示了五种金黄色葡萄球菌菌株在血清中γ-溶血素基因和免疫逃避基因表达的增加。这些发现表明，血清中存在的果糖和甘露糖等碳水化合物支持金黄色葡萄球菌的代谢活性，同时增加了毒力基因表达。
来自血清的氨基酸和肽通过关键中间产物进入碳水化合物代谢和三羧酸循环，进一步促进了金黄色葡萄球菌的代谢适应性。转录组数据显示参与氨基酸分解代谢的酶显著上调。编码谷氨酸、脯氨酸、精氨酸和组氨酸降解酶的基因也上调，表明在血清暴露期间优先分解代谢这些氨基酸。这些发现与之前确定谷氨酸及其前体是支持金黄色葡萄球菌增殖的主要碳源的报告一致，将谷氨酸定位为适应血清反应中的核心氨基酸。
暴露于人血清引发了金黄色葡萄球菌参与脂质和磷脂降解的基因的显著上调。这表明利用宿主来源的脂质作为营养源的能力增强。有趣的是，转录组数据显示tpiA（编码磷酸丙糖异构酶）下调。这表明在此代谢连接处可能存在瓶颈，这可能限制糖酵流通量并影响从血清中存在的脂质中利用碳的效率。
抵消先天免疫防御对于金黄色葡萄球菌在血流感染期间存活至关重要。暴露于人血清后，金黄色葡萄球菌表现出广泛的与毒力相关的基因的强大转录上调。这包括编码补体逃避蛋白、孔形成细胞毒素、超抗原样蛋白和纤维蛋白原结合粘附素的基因。这种协调的免疫逃避策略强调了病原体快速适应免疫压力并增强其在血流中侵袭潜力的能力。
血清暴露也引发了金黄色葡萄球菌显著的氧化应激反应。DIABLO分析将编码过氧化物感应转录调节因子PerR的perR确定为葡萄球菌适应血清的关键分子特征。与此一致，参与类胡萝卜素生物合成的基因上调，表明通过增加金黄色葡萄球菌色素的产生增强了抗氧化防御。同时，scdA的表达升高，表明在氧化应激下激活了对于保持酶和细胞功能至关重要的蛋白质维护途径。
我们的整合方法突出了金黄色葡萄球菌承受人血清暴露的高适应能力。通过协调激活营养获取系统、氧化应激防御和毒力相关机制，金黄色葡萄球菌增强了其在全身性感染期间存活和持续存在的能力。
DISCUSSION
作为致命菌血症的主要原因，金黄色葡萄球菌必须应对血流中营养有限和免疫敌对的条件以建立感染并引起疾病。在血流中，该细菌利用大量毒力因子来逃避细胞和体液免疫的清除。尽管血清缺乏杀菌性免疫细胞，但由于必需营养素（如与转铁蛋白络合的铁离子）的游离形式匮乏，血清对金黄色葡萄球菌而言仍然是一个具有挑战性的环境。本研究在先前工作的基础上，使用多组学方法定义了五种临床分离株的金黄色葡萄球菌共有的血清适应性反应。这种方法通过连接跨基因组、转录组、蛋白质组和代谢组层面的分子变化，提供了微生物响应环境刺激的系统级视图。使用整合的机器学习多变量分析、差异表达谱分析和基于网络的方法，我们的研究确定了金黄色葡萄球菌响应血清在细胞壁生物合成、碳代谢、铁转运和防御机制方面的重编程。
我们整合框架识别的核心输出的实验验证，证实了gapdhB、sucA、sirA、sstD和perR基因对葡萄球菌在血清中适应性的重要性。这些结果与DIABLO模型中观察到的正协变模式一致，表明涉及这些基因的通路之间存在功能上的相互依赖。代谢谱分析显示，己糖及其衍生物通过糖酵解、糖异生、磷酸戊糖途径和三羧酸循环增强了野生型及突变体的代谢活性。虽然甲基丙酮酸可能通过转化为乙酰辅酶A和草酰乙酸部分恢复了sucA突变体的细菌呼吸，但gapdhB突变体仍然代谢受损，反映了不完整的糖异生和磷酸戊糖途径中间产物生成不足。这些结果在强调糖异生对金黄色葡萄球菌在血清暴露期间重要性的同时，进一步强调了GAPDH同源物在维持代谢通量中的非冗余作用。相反，暴露于乙醛酸和衣康酸抑制了金黄色葡萄球菌的代谢。我们构建了一个整合了血清中引发/抑制的预测特征分子的金黄色葡萄球菌代谢图谱。这说明了金黄色葡萄球菌利用血清中多种碳源的灵活性。己糖也被证明可以调节毒力基因表达。血清中存在的肽和氨基酸通过丙酮酸或三羧酸循环中间产物进入糖酵解，从而有助于金黄色葡萄球菌代谢。转录组分析揭示了参与氨基酸分解代谢的关键酶的显著上调。值得注意的是，我们发现将氨基酸转化为2-酮戊二酸的酶基因表达显著增加，表明细菌在血清中利用了这些氨基酸。同时，通过glnA表达减少导致的谷氨酰胺合成下调，表明谷氨酸的利用减少。
铁是决定金黄色葡萄球菌适应性的重要因素。我们的分析证实了多种铁获取机制在铁限制宿主环境中的作用。有趣的是，缺乏参与铁获取的htsA和isdB的突变体显示出与野生型相当的生长速率，表明铁摄取系统存在一定的冗余。这一观察结果与先前报告铁获取系统在金黄色葡萄球菌于血清或血液中培养时上调的研究一致。需要进一步研究以了解铁获取模块在铁限制环境中的特异性，特别是在血流感染期间细菌代谢重编程的背景下。
我们的分析和实验也强调了血清中的氧化应激抵抗。金黄色葡萄球菌色素是一种由金黄色葡萄球菌产生的类胡萝卜素色素，可增强对氧化应激的抵抗。金黄色葡萄球菌色素的生物合成由crtOPQMN操纵子编码，主要由σB激活，其表达受氧化还原响应调节因子的影响。被DIABLO识别为对血清反应特征的过氧化物感应转录抑制因子PerR，通过控制解毒活性氧的基因发挥关键作用。PerR功能的丧失会破坏氧化应激稳态，从而改变σB活性，导致金黄色葡萄球菌色素产生减少。因此，我们的数据证实PerR是连接过氧化物感应与血清暴露时毒力因子调节的关键参与者。
血清暴露也启动了金黄色葡萄球菌对抗无细胞免疫的防御机制。我们观察到毒力相关基因的上调，包括补体结合蛋白、孔形成毒素、超抗原样蛋白和纤维蛋白原结合蛋白。这种反应将使金黄色葡萄球菌为抵抗免疫细胞清除做好准备。逃避宿主抗体和补体系统的机制也被启动。金黄色葡萄球菌对宿主氧化应激的感应和反应也被确定为血清暴露存活的重要因素。未来研究血清如何促进金黄色葡萄球菌在类宿主表面形成生物膜，可以更深入地了解血流感染期间ClfA、Ecb和其他粘附因子的作用。
Conclusion and perspectives
本研究利用多组学分析，包括基于机器学习的方法、差异表达分析和网络分析，揭示了金黄色葡萄球菌响应人血清的主要特征。我们的发现强调了营养获取系统、氧化应激防御和毒力相关机制的并行激活，凸显了金黄色葡萄球菌承受人血清施加的多因素挑战的强大适应能力。虽然血清是无细胞的，不能反映血流感染期间宿主-病原体相互作用的广度，但血清可以作为一个信息丰富的代理，用于理解入侵细菌如何在血液中存活。这里确定的关键葡萄球菌途径可以进一步剖析，以探索葡萄球菌的适应性反应，并确定新的治疗方法的潜在细菌（和宿主）靶点。
Limitations of the study
这里进行的整合分析非常敏感，能检测到连接不同组学数据集的细微模式。然而，关键细菌途径内的代谢灵活性和功能冗余可能不限于特定基因的个体贡献，因此使得难以使用单基因突变体通过实验确认对这些途径有贡献的基因。此外，代谢物（如三羧酸循环中间产物柠檬酸）的个体贡献可以抑制参与铁稳态的基因的转录活性，强调了可能改变单组学读数并进而影响多组学分析的途径之间的串扰。本研究使用商业来源的血清进行葡萄球菌特征的表型确认。虽然这种试剂提供了更多控制，但碳水化合物、金属离子和活性氧的浓度未知，这可能会影响表型输出的显著性。此外，这里分析的数据集是使用混合人血清生成的，而我们的表型确认实验是使用商业来源、批次可控的人血清进行的。血清处理的差异可能解释了我们在铁获取基因中观察到的与先前研究不一致的表型。虽然RPMI被用作本研究中与血清比较的对照培养基，但未来使用富含类宿主代谢物的人类血浆样培养基进行的细菌组学分析，可以完善未来分析中的葡萄球菌特征。
