《Aquaculture Reports》：Apparent digestibility of selected animal protein sources for mud crab
Scylla paramamosain
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本研究为解决水产养殖中抗生素滥用导致的细菌耐药性问题，以及为了阐明益生菌与生物絮团（Biofloc）技术中复杂的微生物群落特征，研究人员结合了培养依赖法与16S rRNA宏基因组学技术，对比分析了商业化益生菌、自制益生菌、生物絮团养殖水以及罗非鱼和黄颡鱼肠道中的细菌群落。研究发现生物絮团养殖水具有最高的微生物多样性，并鉴定出潜在益生菌属（如 Bacillus），同时揭示了系统中普遍存在的多重抗生素耐药菌株，为可持续、生态友好的水产养殖实践提供了重要的微生物学基础。
随着全球人口增长和对高质量动物蛋白需求的增加，水产养殖业已成为食品工业中快速发展的领域。然而，其扩张面临着诸多挑战，包括由致病微生物引起的不可预测的死亡、疾病预测与控制的困难，以及抗生素耐药性的出现。传统上，抗生素被广泛用于防治细菌性疾病，但其过度使用导致了耐药细菌的产生，并对消费者和环境构成了潜在风险。因此，寻找有效、环保且可持续的养殖方法成为行业的迫切需求。在此背景下，生物絮团（Biofloc）技术和益生菌补充剂因其在改善水质、作为微生物蛋白来源、抑制病原体以及促进鱼类健康生长等方面的潜力而受到广泛关注。然而，要优化这些技术并安全应用，必须首先全面了解相关系统中的微生物群落组成、多样性及其功能，尤其是其中可能存在的抗生素耐药性问题。发表在《Aquaculture Reports》上的这项研究，正是为了填补这一知识空白。
为了系统回答上述问题，研究人员采用了一套组合技术路线。他们从孟加拉国诺阿卡利地区的两个商业化生物絮团养殖场以及对照池塘中，采集了包括自制和商业化益生菌、生物絮团养殖水、以及养殖的尼罗罗非鱼和刺黄颡鱼肠道内容物在内的多种样本。研究核心采用了两种互补的微生物分析方法：一是传统的培养依赖法，使用特定培养基分离细菌并通过16S rRNA基因测序进行鉴定；二是非培养依赖的16S rRNA基因宏基因组学（16S rRNA Metagenomics），通过对样本总DNA的V4区域进行高通量测序，全面解析微生物群落的组成和多样性。此外，研究还通过Kirby-Bauer纸片扩散法，对分离出的代表性细菌菌株进行了针对15种常用抗生素的敏感性测试，并计算了多重抗生素耐药性指数。
3.1. 基于培养依赖法的16S rRNA基因测序进行细菌鉴定
研究人员使用三种培养基（BA、MRS、TCBS）从所有样本中共分离出37株细菌，并对其中的33株进行了16S rRNA基因测序鉴定。结果显示，Bacillus（芽孢杆菌属）是最常见的属，其中B. subtilis（枯草芽孢杆菌）是被鉴定出最多的物种。从系统发育树分析可见，这些分离株主要属于厚壁菌门、变形菌门和拟杆菌门。具体而言，商业化益生菌中主要分离到多种Bacillus菌种；自制益生菌中则鉴定出Bacillus、Oceanobacillus kimchi、Enterobacter hormaechei和Acinetobacter haemolyticus；生物絮团养殖水中也以多种Bacillus菌种为主；而鱼肠道样本中则鉴定出Bacillussp.、Serratia marcescens、Staphylococcus gallinarum、Chryseobacteriumsp.等。
3.2. 基于非培养依赖的16S rRNA宏基因组学分析细菌群落的多样性和分布
通过对12个样本进行宏基因组测序，研究获得了平均70,653条有效序列，共鉴定出3892个扩增子序列变异。α多样性分析（如Chao1、Shannon指数）明确显示，生物絮团养殖水的微生物多样性和丰富度显著高于益生菌、生物絮团养殖鱼和池塘养殖鱼样本。主坐标分析和非度量多维尺度分析进一步表明，不同来源的样本其微生物群落结构存在明显差异，例如自制益生菌与商业化益生菌、生物絮团水与鱼类肠道样本均形成了独立的聚类。
3.2.1. 样本类型影响微生物群落的多样性和丰富度
在门水平上，所有样本中最常见的十个门包括变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、梭杆菌门等。其中，自制益生菌以变形菌门为主，而商业化益生菌则以厚壁菌门占绝对优势。所有生物絮团水样中，变形菌门均为最优势门。在池塘和生物絮团系统养殖的罗非鱼肠道中，厚壁菌门是绝对优势门（相对丰度>90%）。而在黄颡鱼肠道中，池塘养殖样本以梭杆菌门为优势菌，生物絮团养殖样本则以变形菌门为优势菌。
在属水平上，自制益生菌中的优势菌为Acetobacter（醋杆菌属），而商业化益生菌中则以Lysinibacillus（赖氨酸芽孢杆菌属）、Cohnella、Bacillus和Brevibacillus（短芽孢杆菌属）为主。生物絮团水中的优势属与环境功能相关，如Candidatus_Aquiluna、Devosia等。罗非鱼肠道中，无论养殖环境如何，Bacillus都是最优势的属。相比之下，生物絮团养殖的黄颡鱼肠道中，Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia、Enterobacter（肠杆菌属）、Lactobacillus（乳杆菌属）等属更为突出，而池塘养殖黄颡鱼则以Cetobacterium和Clostridium_sensu_stricto_1为主。
3.2.2. LEfSe分析
线性判别分析效应大小分析进一步揭示了生物絮团水和生物絮团鱼肠道样本之间的标志性差异菌群。生物絮团水样本富集了拟杆菌门、根瘤菌目、丛毛单胞菌科和Thermomonas等类群；而生物絮团鱼肠道样本则富集了厚壁菌门、梭菌纲、毛螺菌目和毛螺菌科等类群。
3.2.3. 基于PICRUSt的基因功能分析
通过PICRUSt对微生物群落功能进行预测发现，不同样本中高表达的基因功能存在差异。例如，自制益生菌中高表达的基因可能与转座酶、复制重组等功能相关；商业化益生菌中则富集与无机离子转运代谢相关的基因；生物絮团水样本中与脱氧糖生物合成和细胞膜生物合成相关的基因功能突出；而生物絮团养殖鱼肠道样本则含有更多与DNA转录相关的基因。
3.3. 所研究细菌分离株的抗生素敏感性模式
对27株代表性分离株进行的抗生素敏感性测试显示，19株菌对三种或以上抗生素具有耐药性，被认为是多重耐药菌。其中，从自制益生菌中分离的菌株总体耐药性较低，而从生物絮团水或鱼肠道中分离的部分菌株（如B. paramycoides、Chryseobacteriumsp.、B. subtilis、S. marcescens）甚至对全部15种测试抗生素都表现出耐药性。最有效的抗生素是阿米卡星、氯霉素和庆大霉素。相反，细菌对青霉素G和头孢他啶的耐药率最高，表明这些抗生素可能被更频繁地使用。
3.4. 所研究细菌分离株的多重抗生素耐药性指数
多重抗生素耐药性指数计算结果显示，62.96%的分离株MAR指数大于0.2，表明它们来源于抗生素污染风险较高的环境。特别是四株对全部抗生素耐药的菌株，其MAR指数为1.0，提示曾暴露于高强度的抗生素压力下。
研究结论与重要意义
本研究综合运用培养与非培养方法，首次系统揭示了孟加拉国生物絮团养殖系统中益生菌、养殖水及养殖鱼类肠道的微生物群落全景图。主要结论包括：1) 生物絮团养殖水拥有最高的微生物多样性和丰富度；2) 自制益生菌与商业化益生菌在微生物组成上存在显著差异，前者以变形菌门为主，后者以厚壁菌门为主；3) 养殖环境显著影响鱼类肠道菌群，例如罗非鱼肠道始终以Bacillus为绝对优势菌，而黄颡鱼肠道菌群则因养殖系统（池塘 vs. 生物絮团）不同而发生显著改变；4) 尽管养殖水与鱼类肠道菌群存在差异，但在鱼类肠道中仍检测到包括Bacillus、Lactobacillus在内的多个潜在益生菌属；5) 更重要的是，在研究的样本中普遍存在多重抗生素耐药菌，尤其在生物絮团水和鱼肠道样本中发现了对全部测试抗生素耐药的“超级细菌”，这敲响了水产养殖中抗生素滥用问题的警钟。
这项研究的意义深远。首先，它增进了我们对生物絮团和益生菌应用背景下复杂微生物生态系统的理解，为优化这些技术以提高水产养殖的可持续性和生产力提供了关键数据。其次，研究揭示了不同来源益生菌制剂的微生物组成差异，为开发和应用适合特定养殖环境的定制化益生菌产品提供了依据。最后，也是最紧迫的，研究结果凸显了水产养殖环境中抗生素耐药性问题的严重性。自制益生菌中菌株较低的耐药性提示，基于天然发酵的本地化益生菌制备可能是一种更安全的替代方案。总之，该研究强调了在推进可持续水产养殖技术的同时，必须加强对微生物群落动态的监控并严格管理抗生素的使用，这对保障水产食品安全、维护生态系统健康及公共安全至关重要。
