《Atherosclerosis plus》：Role and mechanism of G9A-BMP2 in calcification-induced formation of unstable plaque
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血管钙化如何导致动脉粥样硬化斑块不稳定，其上游调控机制尚不清楚。本研究聚焦于组蛋白甲基转移酶G9A，通过体内（ApoE–/–小鼠和人类颈动脉斑块）与体外（A7R5细胞）模型，首次系统阐明了G9A通过正向调控BMP2-RUNX2轴，驱动血管平滑肌细胞（VSMCs）成骨表型转换和钙化，从而促进斑块不稳定的新机制。该研究为理解钙化与斑块稳定性的关系提供了超越生物力学视角的分子解释，并提示G9A是潜在的抗钙化与斑块稳定治疗靶点。
想象一下，我们身体的血管如同城市中纵横交错的供水管道。健康的管道内壁光滑，水流畅通。然而，随着年龄增长、不健康饮食（如高脂饮食）以及高血压、糖尿病等疾病的影响，一些管道内壁会悄悄“生锈”——形成动脉粥样硬化斑块。更棘手的是，这些斑块有时会变得像鸡蛋壳一样脆弱易碎，即“不稳定斑块”，一旦破裂，内部的“垃圾”（如脂质和细胞碎片）暴露，会迅速触发血栓形成，堵塞血管，导致心肌梗死或脑中风，危及生命。
是什么让这些斑块变得不稳定？传统观点认为，斑块内的钙盐沉积（血管钙化）像混凝土一样，可能会让斑块变“硬”从而稳定。但越来越多的临床观察发现，事实可能恰恰相反：许多钙化斑块反而更不稳定。这就像一个悖论：钙化到底是“稳定器”还是“破坏王”？其背后的分子机制长期以来是心血管研究领域的“黑箱”。解开这个谜团，不仅对理解疾病进程至关重要，也可能为开发稳定斑块、预防心脑血管事件的新疗法提供关键靶点。
近期，一项发表于《Atherosclerosis Plus》的研究为我们揭开了这个“黑箱”的一角。该研究首次系统阐明了一个新颖的机制：一种名为G9A（常染色质组蛋白甲基转移酶2， EHMT2）的“表观遗传工程师”，通过激活一个关键的骨形成信号通路（BMP2-RUNX2轴），驱动了血管壁平滑肌细胞的“叛变”（成骨表型转换）和钙化，最终导致了斑块的不稳定。这项研究不仅将钙化与斑块不稳定性在分子层面上直接联系起来，还指出了一个全新的潜在治疗方向——靶向G9A。
为了探究这一机制，研究人员采用了多层次的研究策略。在人体样本方面，他们收集了2016年至2022年间在宁夏医科大学总医院接受颈动脉斑块切除术患者的42例病理标本（其中29例钙化，13例非钙化），用于分析钙化与斑块稳定性的临床关联。在动物模型上，他们使用载脂蛋白E基因敲除（ApoE–/–）小鼠，并给予高脂饮食喂养30周，以模拟人类动脉粥样硬化及钙化进程。在细胞水平，研究采用大鼠胸主动脉平滑肌细胞系（A7R5细胞），通过基因敲低和过表达技术精确操控G9A的活性，并在β-甘油磷酸诱导下建立体外钙化模型。关键技术方法包括：苏木精-伊红（H&E）、茜素红、天狼星红、油红O等多种组织化学染色以评估斑块形态、钙化、胶原和脂质含量；免疫组织化学和免疫荧光染色用于定位和定量关键蛋白（如G9A、H3K9me2、BMP2、RUNX2、CD68、α-SMA）的表达；蛋白质印迹法（Western Blot）和实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）用于检测蛋白和信使核糖核酸（mRNA）水平的变化；以及通过慢病毒载体进行G9A基因的敲低和过表达操作。
研究结果揭示了以下关键发现：
1. 钙化斑块更具不稳定性
对42例人类颈动脉斑块样本的分析显示，钙化斑块中不稳定斑块的比例高达83.33%，显著高于非钙化斑块的30.76%。这从临床病理层面直接证实了钙化与斑块不稳定性之间的强烈关联。
2. 钙化区域与脂质蓄积正相关，并促进斑块不稳定特征
在高脂饮食的ApoE–/–小鼠和人类颈动脉中，钙化面积与脂质池含量呈正相关。更重要的是，在钙化区域，标志炎症的巨噬细胞（CD68阳性）浸润显著增加，而维持斑块结构完整性的血管平滑肌细胞（VSMCs， α-SMA阳性）则显著减少。这两点正是斑块不稳定的经典组织学特征，表明钙化过程伴随着促不稳定的微环境改变。
3. 钙化区域中BMP2和RUNX2表达上调
骨形态发生蛋白2（BMP2）及其下游关键转录因子Runt相关转录因子2（RUNX2）是驱动血管钙化的核心信号轴。研究发现，在高脂饮食小鼠和人类钙化斑块中，BMP2和RUNX2的表达水平均显著升高，提示该通路在病理性钙化中被激活。
4. 钙化区域中G9A和H3K9甲基化水平升高
G9A是一种催化组蛋白H3第9位赖氨酸二甲基化（H3K9me2， 通常与基因转录抑制相关）的组蛋白甲基转移酶。研究发现在高脂饮食小鼠和人类钙化斑块中，G9A蛋白及其催化产物H3K9me2的水平均显著上调，表明G9A介导的表观遗传修饰在钙化过程中可能扮演重要角色。
5. 敲低G9A表达可减弱血管平滑肌细胞钙化
在体外实验中，当使用慢病毒敲低A7R5细胞中的G9A基因后，细胞钙化程度（茜素红染色面积）明显减轻。同时，成骨相关基因BMP2和RUNX2的mRNA和蛋白表达水平下降，而平滑肌细胞表型标志物α-SMA的表达则回升。这证明抑制G9A可以逆转血管平滑肌细胞的成骨表型转换，从而抑制钙化。
6. 过表达G9A可促进血管平滑肌细胞钙化
相反，在A7R5细胞中过表达G9A基因，则会显著加剧细胞钙化，并同时上调BMP2和RUNX2的表达。这一正反两方面的实验，确立了G9A对BMP2-RUNX2轴和血管平滑肌细胞钙化的“因果”驱动关系。
研究结论与讨论强调了本研究的深刻意义。 该研究首次超越关联性描述，在动脉粥样硬化背景下，将G9A的表观遗传调控功能直接与驱动钙化的核心通路——BMP2-RUNX2轴联系起来。研究发现G9A通过（可能以间接方式）激活BMP2信号，上调RUNX2，从而驱动血管平滑肌细胞向成骨样细胞转分化，促进钙化结节形成。这一“活跃的”钙化过程伴随胶原减少、巨噬细胞增多和平滑肌细胞减少，共同构成了斑块不稳定的基础。这为“为何钙化常与斑块不稳定相关”这一临床难题提供了超越生物力学（如微钙化应力）的分子生物学解释。
研究还指出一个有趣的表观遗传悖论：通常与基因沉默相关的G9A，却“激活”了BMP2和RUNX2的表达。作者推测，G9A可能并非直接激活这些基因，而是通过沉默一个或多个强效的内源性成骨分化抑制因子（如基质Gla蛋白MGP或Smad6/7等），以“去抑制”的方式间接启动了成骨程序。这一机制丰富了我们对G9A在疾病不同阶段可能发挥不同功能（阶段特异性和细胞类型特异性）的理解。
综上所述，这项由Wenjuan Yang、Zheng Ma、Ying Cui和Shaobin Jia完成的研究，定义了一条由G9A经BMP2信号通路促进血管钙化与斑块不稳定的新颖机制通路。这一发现不仅深化了对动脉粥样硬化复杂病理机制的认识，更从转化医学角度提示，靶向G9A或其下游通路的抑制剂，未来或可成为同时延缓钙化进展和促进斑块稳定的“一石二鸟”式治疗新策略。当然，该机制中G9A沉默的具体靶基因、以及G9A抑制剂在动物模型中的干预效果，仍是未来需要探索的重要方向。
