《Proceedings of the National Academy of Sciences》：TROP2-targeted NIR-II fluorescence imaging for visualizing surgical margins and metastatic sentinel lymph nodes in breast cancers
编辑推荐：
这篇研究报道了一种靶向TROP2的近红外二区（NIR-II）荧光探针TTP-ICG，及其配套的快速孵育成像法（RIIM）。该技术能够在短短8分钟内，高特异性地识别乳腺癌组织与转移性前哨淋巴结（SLN），为术中同时实现精准的切缘评估和淋巴结分期提供了快速、准确的双重解决方案，有望推进精准乳腺癌外科手术的临床转化。
成功合成与表征TTP-ICG
研究人员通过NHS酯化学将ICG与TROP2靶向环肽（TTP）共价连接，合成了探针TTP-ICG。与游离ICG相比，TTP-ICG的吸收和发射光谱略有红移，但保留了强烈的808纳米吸收和NIR-II拖尾发射特性。高效液相色谱（HPLC）分析和质谱确认了成功合成，TTP-ICG的纯度超过90%，其分子量与理论值精确吻合。
TTP-ICG在乳腺癌细胞中展现高TROP2特异性靶向能力
在细胞水平评估中，TTP-ICG在TROP2高表达的细胞系（如MCF-7、过表达TROP2的MDA-MB-231和4T1细胞）中展现出时间依赖性的细胞内化，其平均荧光强度（MFI）显著高于非靶向对照探针（CP-ICG）。在共培养体系中，TTP-ICG能特异性地标记TROP2高表达细胞，而与TROP2低表达细胞区分开来。通过40倍过量游离TTP的竞争性抑制，TTP-ICG的内化被显著抑制，证实了其靶向特异性。此外，溶血实验和细胞活力实验表明TTP-ICG具有良好的血液相容性和生物安全性。
TTP-ICG在体内实现优异的肿瘤特异性
在小鼠皮下肿瘤模型中，静脉注射TTP-ICG后，随着探针在体内被清除，肿瘤与正常组织的信噪比（TNR）逐渐升高，在注射后48小时达到峰值。TTP-ICG在TROP2高表达肿瘤中的TNR显著高于对照探针，且超过了肉眼识别所需的罗斯标准（Rose criterion）阈值（TNR > 5）。在双侧肿瘤模型中，TTP-ICG优先积聚于TROP2高表达的肿瘤。药代动力学研究显示TTP-ICG血液清除迅速（半衰期 t1/2= 15.57分钟）。48小时后的生物分布显示，荧光信号主要集中于肿瘤和肝脏。安全性评估中，血液学、生化学以及主要器官的组织病理学分析均未发现明显毒性。
TTP-ICG在各种小鼠模型中精准引导肿瘤切除
在自发性乳腺癌的MMTV-PyVT转基因小鼠模型中，TTP-ICG能够在体内和离体成像中清晰区分恶性肿瘤组织与正常乳腺组织，诊断准确性极高（受试者工作特征曲线下面积 AUC = 0.983）。荧光引导的显微分割显示，荧光信号与肿瘤侵袭区域、苏木精-伊红（H&E）染色及TROP2免疫组化染色结果高度一致。在多发微小肿瘤模型（小至2毫米）中，TTP-ICG实现了100%的病灶检出率。更重要的是，在肌肉内肿瘤侵袭模型中，基于TTP-ICG的NIR-II成像能精确勾勒肿瘤边界，指导完全切除。与单纯白光引导切除相比，NIR-II荧光引导显著降低了肿瘤复发率（0% 对比 71%至86%），并提高了小鼠的生存率。
TTP-ICG在各种小鼠模型中准确评估前哨淋巴结转移状态
在小鼠腘窝淋巴结（PoLN）转移模型中，通过足垫皮下注射TTP-ICG，转移性淋巴结（PoMLN）在注射后特定时间点（如4小时或12小时）显示出显著高于非转移性淋巴结的荧光信号。在双侧淋巴结转移模型中，TROP2高表达的转移性淋巴结比TROP2低表达的转移性淋巴结积聚更多探针。系统性评估显示，TTP-ICG能够高精度区分转移性与非转移性淋巴结（对于腘窝淋巴结，AUC = 0.952；对于骶淋巴结，AUC = 0.953），并对直径小于1毫米的微转移灶表现出高检测灵敏度。早期建模实验证实，该技术能够在肿瘤转移发生早期（建模后15天）检测到微转移灶。
TTP-ICG为基础的快速孵育成像法（RIIM）促进离体成像识别乳腺肿瘤组织
为加速临床转化，研究团队开发了一种离体快速孵育成像法（RIIM）。优化后，仅需用20微克/毫升的TTP-ICG孵育组织3分钟，即可获得最佳信噪比。在小鼠组织中，该方法能清晰区分TROP2高表达肿瘤、TROP2低表达肿瘤和正常乳腺组织。在临床患者组织验证中（涉及48例乳腺癌和11例纤维腺瘤），RIIM显示乳腺癌组织的MFI和TROP2 H-Score均显著高于正常乳腺组织及纤维腺瘤组织，且MFI与H-Score呈强正相关。该方法对区分乳腺癌与正常组织的诊断性能优异（AUC = 0.907），对区分乳腺癌与纤维腺瘤的诊断性能同样出色（AUC = 0.968）。研究还根据TROP2表达水平分析了不同乳腺癌亚型（三阴性乳腺癌TNBC、激素受体阳性/人表皮生长因子受体2阴性HR+/HER2-、HER2阳性HER2+）的MFI差异，与已知的TROP2表达模式一致。空间荧光图谱分析显示，在肿瘤-正常组织交界处，癌区荧光信号显著高于相邻正常区域，并与组织病理学特征和TROP2表达模式高度一致。
TTP-ICG为基础的快速孵育成像法（RIIM）促进离体成像识别转移性前哨淋巴结
RIIM同样适用于区分转移性与非转移性淋巴结。在小鼠淋巴结模型中，TROP2高表达的转移性淋巴结经RIIM处理后的MFI显著高于TROP2低表达的转移性淋巴结和非转移性淋巴结。在来自乳腺癌患者的71份淋巴结样本中，经病理证实的转移性淋巴结（MLNs）显示出比非转移性淋巴结（NLNs）更高的MFI，且MFI与TROP2 H-Score强相关。ROC分析显示其诊断性能良好（AUC = 0.929）。沿感兴趣线的空间分析证实，转移灶区域的荧光强度远高于淋巴结内的正常区域，且荧光信号与H&E染色确认的转移灶共定位。
讨论
本研究报道了通过噬菌体展示技术筛选出的TROP2靶向肽TTP与ICG结合形成的NIR-II荧光探针TTP-ICG。该探针具有高TROP2靶向特异性和亲和力，能够实现术中同时评估保乳手术切缘和前哨淋巴结转移状态。与既往的整合素αvβ3靶向探针相比，TTP-ICG在区分肿瘤与正常组织方面表现出更高的信噪比和诊断性能，并能有效检测微转移灶。相较于抗体类探针，TTP-ICG凭借其小分子量，具有肿瘤穿透性更好、代谢清除更快的优势。研究优化的RIIM将评估时间缩短至约8分钟，快于传统的术中冰冻切片和印片细胞学检查。针对TROP2表达的异质性，研究提出了双阈值诊断策略：对于乳腺组织，MFI高于78判定为恶性，低于38判定为正常；对于淋巴结，MFI高于80判定为转移，低于49判定为非转移。这种策略有望在近半数的明确病例中避免冰冻切片分析，提高手术效率。然而，本研究也存在一定局限性，包括样本量相对较小、需进一步探索体内应用的安全性、存在假阴性风险，以及对MFI处于中间灰区病例的评估可能延长时间等。未来的研究方向包括扩大临床验证队列、开发针对TROP2低表达肿瘤的多靶点策略，以及推动体内给药模式的应用。
材料与方法
该部分详细描述了研究中使用的实验方法，主要包括：在转基因小鼠模型中区分良恶性组织、在肌肉内肿瘤侵袭模型中进行荧光引导的肿瘤切除、在单侧腘窝淋巴结转移模型中区分转移与非转移淋巴结、患者入组标准，以及用于人类组织的TTP-ICG快速孵育成像法具体操作流程。所有动物实验和临床研究均遵循相关伦理审查委员会批准的程序。
