《Biochemical and Biophysical Research Communications》：C-mannosyltransferase Dpy19l1l regulates body axis formation via secretion of SCO-spondin in zebrafish
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本文聚焦于一种进化保守但功能未知的蛋白质翻译后修饰——C-甘露糖化。为解决其在脊椎动物发育中的生理功能问题，研究人员利用CRISPR-Cas9技术构建了斑马鱼dpy19l1l与dpy19l3基因敲除模型，并结合质谱分析与活体成像技术展开研究。研究发现，dpy19l1l敲除会导致类似脊柱侧弯的“卷尾向下”表型，并首次鉴定出巨大细胞外糖蛋白SCO-spondin是其关键的体内底物。该酶通过C-甘露糖化修饰SCO-spondin，对其正常分泌至脑脊液并形成Reissner纤维至关重要，从而揭示了C-甘露糖化在维持脊椎动物体轴挺直中的关键作用，为理解脊柱侧弯等疾病的分子发病机制提供了新视角。
在生命体复杂而精妙的发育过程中，蛋白质的功能不仅取决于其氨基酸序列，还受到一系列翻译后修饰的精细调控。其中，糖基化修饰扮演着至关重要的角色。在众多糖基化类型中，有一种相对神秘且研究较少的修饰——C-甘露糖化。这种修饰特指单个甘露糖分子通过碳碳键共价连接到色氨酸（Trp）残基吲哚环的C2位置上，通常发生在血小板反应蛋白1型重复序列（TSR）结构域内，由DPY19家族的糖基转移酶催化完成。尽管在多种细胞过程中如蛋白质折叠、稳定和分泌中都有C-甘露糖化的身影，但其在脊椎动物发育中的具体生理功能和病理关联却长期笼罩在迷雾之中，特别是在体轴形成这一基础而关键的发育事件中，它的作用更是未知。
为了拨开这层迷雾，揭示C-甘露糖化在生命早期塑造笔直身体轴线中的角色，一个研究团队以斑马鱼为模式生物，展开了深入探索。他们的研究成果最终发表在国际知名期刊《Biochemical and Biophysical Research Communications》上。
研究人员为开展这项研究，综合运用了多种关键技术方法。首先，他们利用CRISPR-Cas9基因组编辑技术，成功构建了斑马鱼dpy19l1l和dpy19l3基因敲除品系，用以模拟C-甘露糖化功能缺失的表型。其次，为了验证酶活性和鉴定底物，研究采用了基于果蝇S2细胞的异源表达系统，结合镍柱亲和层析纯化重组蛋白。第三，关键的修饰位点鉴定依赖于高分辨液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析，精准解析了C-甘露糖化的发生位点。第四，为了在活体中直观观察关键蛋白SCO-spondin的定位与Reissner纤维的形成，研究利用了表达GFP标记SCO-spondin的转基因斑马鱼品系进行活体共聚焦显微成像。此外，通过原位杂交链式反应（HCR）技术分析了dpy19l1lmRNA的组织表达谱。研究中使用的斑马鱼样本为AB和Tübingen品系的杂交后代。
研究结果
3.1. 斑马鱼Dpy19家族具有C-甘露糖转移酶活性
为了探究斑马鱼Dpy19家族成员是否具有C-甘露糖转移酶活性，研究团队将斑马鱼dpy19l1l和dpy19l3的cDNA在果蝇S2细胞（本身缺乏C-甘露糖转移酶活性）中表达，并以人源R-脊椎蛋白1（Rspo1）作为模型底物。质谱分析结果显示，在表达Dpy19l1l或Dpy19l3的细胞中，Rspo1 TSR结构域内的色氨酸残基（W153或W156）被特异性单甘露糖化，而在对照细胞中仅检测到未修饰的肽段。这证实了斑马鱼Dpy19l1l和Dpy19l3与其哺乳动物同源物功能保守，能够催化底物特异性的C-甘露糖化。
3.2. dpy19l1l敲除导致斑马鱼出现“卷尾向下”表型
为了研究缺失C-甘露糖转移酶的体内表型后果，研究人员通过CRISPR-Cas9技术敲除了斑马鱼的dpy19l1l和dpy19l3基因。结果表明，dpy19l3敲除鱼没有表现出明显的异常。然而，dpy19l1l敲除则导致了显著的表型：纯合子（dpy19l1l-/-）斑马鱼在发育早期（2-3天受精后）即出现不同程度的体轴弯曲，即“卷尾向下”表型，类似于脊柱侧弯。值得注意的是，当双亲均为纯合突变体时（母源合子突变，MZ dpy19l1l-/-），表型出现更早、更严重，提示dpy19l1l是一个母源表达的基因，母体贡献的mRNA对正常体轴发育至关重要。约90%的MZ突变体鱼因未能膨起鱼鳔而在1个月后死亡。
3.3. SCO-spondin是斑马鱼中由Dpy19l1l修饰的C-甘露糖化底物蛋白之一
为了寻找导致dpy19l1l敲除表型的关键底物蛋白，研究人员通过序列比对，将目标锁定在含有大量TSR结构域的巨型细胞外糖蛋白——SCO-spondin（Sspo）上。Sspo是脊椎动物中枢神经管内一种称为Reissner纤维（RF）的丝状细胞外聚合物的主要成分，对维持体轴挺直至关重要。原位杂交显示dpy19l1lmRNA在表达sspo的底板细胞中富集。通过在S2细胞中表达斑马鱼Sspo的截短片段（TSR6-8和C端TSR26-28区域），并进行质谱分析，研究首次直接证实了Dpy19l1l和Dpy19l3能够催化Sspo上多个色氨酸残基的C-甘露糖化。具体而言，Dpy19l1l修饰了TSR6中的两个色氨酸和TSR27中的一个色氨酸；而Dpy19l3则在TSR7、TSR26、TSR27和TSR28中各修饰了一个色氨酸。
3.4. Dpy19l1l通过调控SCO-spondin分泌来维持Reissner纤维的形成
为了探究Dpy19l1l缺失如何影响体轴，研究人员利用表达GFP标记Sspo的转基因斑马鱼品系（scospondin-GFPut24）进行活体成像。在野生型或dpy19l1l-/+胚胎中，Sspo-GFP能被正常分泌到脑脊液中，并在脊髓中央管内形成一条笔直、连续的Reissner纤维。然而，在表现出体轴弯曲的dpy19l1l-/-纯合突变体胚胎中，Reissner纤维结构完全消失，Sspo-GFP无法正常分泌，而是异常累积在底板细胞的基底侧和屈曲器官中，形成点状聚集体。即使在表型正常的dpy19l1l-/-胚胎中，Reissner纤维也极其纤细且形成延迟。进一步观察表明，dpy19l1l的缺失并不影响脊髓中央管内运动纤毛的正常摆动。这些结果说明，Dpy19l1l是通过促进Sspo的正常分泌来保证Reissner纤维的组装，而非通过影响纤毛功能。
研究结论与意义
本研究系统性地阐明了C-甘露糖化在脊椎动物发育中的一个关键生理功能。论文得出结论：斑马鱼C-甘露糖转移酶Dpy19l1l通过催化SCO-spondin蛋白的C-甘露糖化修饰，对其正常折叠、分泌以及后续在脑脊液中形成Reissner纤维至关重要。该纤维是维持体轴挺直的核心结构。当dpy19l1l基因缺失时，SCO-spondin的C-甘露糖化受阻，导致其分泌缺陷和细胞内滞留，Reissner纤维无法正常形成，最终引发斑马鱼胚胎出现类似脊柱侧弯的“卷尾向下”表型。
这项研究的意义重大且深远。首先，它首次在活体水平上明确了C-甘露糖化对于脊椎动物体轴形成的不可或缺的作用，填补了该领域长期以来的知识空白。其次，研究将Dpy19l1l、其底物SCO-spondin、Reissner纤维的形成以及体轴畸形表型清晰地串联起来，揭示了一条从分子修饰到细胞分泌，再到组织结构和整体表型的完整通路。这不仅深化了我们对糖基化修饰调控发育的理解，也为探究脊柱侧弯等体轴畸形的分子发病机制提供了一个全新的视角和潜在靶点。尽管人类Reissner纤维的存在和功能尚存争议，但本研究建立的斑马鱼模型为未来筛选可能通过替代或互作通路来矫正体轴形态的药物干预手段提供了有价值的平台。总之，该工作揭示了内质网定位、受母源影响的C-甘露糖化在脊椎动物早期发育中的核心机制，为相关基础研究和疾病探索开辟了新道路。
