《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Immune landscape in NOD.H-2h4 mouse model thyroid revealed by single-cell RNA sequencing
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本研究针对桥本氏甲状腺炎中不同甲状腺细胞类型的免疫失调作用不明的问题，通过对NOD.H-2h4小鼠进行单细胞RNA测序分析，构建了疾病不同阶段的甲状腺免疫微环境单细胞图谱。研究揭示了甲状腺滤泡细胞转录可塑性和Treg功能失调在疾病进展中的潜在驱动作用，为理解该疾病的细胞机制提供了宝贵数据集。
想象一下，身体的“防线”——免疫系统，某天突然调转枪口，对生产重要“能源激素”的甲状腺工厂发起猛攻。这就是桥本氏甲状腺炎（Hashimoto's thyroiditis, HT），一种常见的自身免疫性疾病。患者体内淋巴细胞大量浸润，甲状腺滤泡细胞（thyrocytes）被无情破坏，导致永久性甲状腺功能减退，并增加了罹患甲状腺恶性肿瘤的临床风险。尽管我们已对HT有所了解，但在疾病的进展过程中，甲状腺内部究竟上演着怎样复杂的“细胞对话”？每种细胞类型具体扮演了何种“角色”？这些关键细节如同笼罩在迷雾中，至今尚未被完全阐明。
为了拨开迷雾、揭示HT动态的免疫景观，研究人员将目光投向了NOD.H-2h4小鼠——一种能够自发产生碘诱导性自身免疫性甲状腺炎，并能很好模拟人类HT病理特征的理想动物模型。在发表于《Biochemical and Biophysical Research Communications》上的这项研究中，研究团队利用先进的单细胞RNA测序技术，绘制了NOD.H-2h4小鼠在疾病三个关键时间点（4周、8周、16周）的甲状腺单细胞转录组图谱，旨在解析细胞组成的动态变化、免疫细胞与甲状腺细胞之间的相互作用，为理解HT的发病机制和寻找潜在治疗靶点提供新见解。
研究主要采用了单细胞RNA测序技术构建和分析甲状腺组织单细胞文库。实验对象为36只雌性NOD.H-2h4小鼠，通过饮用含0.05% NaI的水进行诱导，并在三个时间点采集甲状腺组织进行测序。同时，研究者通过流式细胞术和多重免疫荧光技术，对关键发现（如Treg表型和APP-CD74配受体对的空间共定位）进行了实验验证，以支撑计算推断的结果。
3.1. NOD.H-2h4小鼠甲状腺免疫微环境的单细胞转录组图谱
研究者对来自三个疾病阶段甲状腺组织的总计38，461个细胞进行了分析。通过降维聚类识别出12个主要细胞谱系，其中T细胞是最主要的免疫细胞群，甲状腺滤泡细胞是第二大群体。整体炎症水平在8周和16周显著升高。值得注意的是，甲状腺谱系的关键转录因子Nkx2-1（Ttf-1）的活性在甲状腺滤泡细胞中显著下调，提示其细胞特性和功能逐步丧失。跨物种相关性分析证实，该小鼠模型的炎症转录特征与人类HT患者高度保守。此外，基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）显示，甲状腺滤泡细胞中显著富集了“同种异体移植排斥”通路，涉及抗原加工呈递和细胞毒性效应反应基因的上调。
3.2. 细胞间通讯网络分析揭示配体-受体相互作用
通过分析细胞间通讯网络，研究者发现免疫细胞主要作为信号接收者，而甲状腺滤泡细胞、成纤维细胞等基质细胞则显示出显著的信号发出活性。在众多信号通路中，APP（淀粉样前体蛋白，Amyloid Precursor Protein）信号通路显示出高强度的通讯能力，其靶向抗原呈递细胞（Antigen-Presenting Cells, APCs）。重要的是，推断出的App-Cd74轴比已知的Mif-Cd74通路拥有更强的通讯强度。该轴介导了甲状腺滤泡细胞/基质细胞与APC之间的潜在互动。APC随后通过MHC-I和MHC-II通路与T细胞相互作用。研究推测，App-Cd74轴可能通过激活APC并促进其向T细胞呈递抗原，从而加剧自身免疫性组织损伤。
3.3. T细胞的转录异质性
在15，138个T细胞中，研究者鉴定出13个不同的T细胞亚群，包括Na?ve T细胞、Ectopic Thymocytes（异位胸腺细胞）、Th1、Th17、调节性T细胞（Regulatory T cells， Treg）、CD8+细胞毒性T细胞（Cytotoxic T lymphocytes， CTL）等。随着疾病进展，促炎效应亚群（如Th1、CD8+CTL、自然杀伤T细胞（NKT））的比例显著增加。
3.4. 将双阳性T细胞鉴定并验证为异位胸腺细胞
研究者在数据集中识别出一群CD4+CD8+的双阳性T细胞。通过转录组分析和免疫荧光验证，证实这群细胞来源于与甲状腺组织粘连的异位胸腺结构，在未诱导小鼠中占淋巴细胞主体，并且在疾病进程中持续存在。由于其发育表型和空间上独立于炎症实质，它们被归类为异位胸腺细胞，并从后续的细胞通讯分析中排除。
3.5. T细胞的拟时序和发育轨迹
拟时序（pseudotime）轨迹分析显示T细胞可分为三个状态。随着疾病进展，处于早期状态的细胞（如Na?ve T细胞）比例下降，而代表分化功能表型的State 2和State 3细胞扩张。功能富集分析表明，State 2细胞与细胞毒性、自身免疫反应通路相关，而State 3细胞则与免疫调节、免疫耐受通路相关。
3.6. CD4+T细胞重塑和Treg功能不稳定
尽管Treg细胞的比例随疾病进展而增加，但其关键转录因子Foxp3的表达及相关通路显著抑制，提示其功能衰竭。流式细胞术验证也显示NaI诱导组小鼠甲状腺中FOXP3蛋白表达减弱。基因调控网络（Gene Regulatory Network， GRN）分析识别出调控Foxp3的关键转录因子，其活性在晚期疾病阶段显著下降，与Treg功能障碍的表型相吻合。相比之下，Th1细胞显示出广泛的免疫通路激活，可能加剧炎症。
3.7. CD8+CTL和NKT的积累
CD8+CTL和NKT细胞比例显著增加，它们在组织中主要负责破坏作用。GSEA分析显示这些细胞在疾病中后期的细胞毒性活性增强，并富集了MHC介导的抗原呈递过程，表明存在一个组织损伤的正反馈循环。
3.8. B细胞和树突状细胞对抗原呈递和免疫激活的贡献
B细胞被分为6个簇，主要包括滤泡B细胞、记忆B细胞和浆细胞。GSEA显示，随着疾病进展，B细胞的抗原反应和MHC复合体呈递相关通路被上调，提示B细胞除了产生自身抗体外，还可能作为APC来维持T细胞活化。树突状细胞（Dendritic cells， DCs）被分为cDC1、cDC2和pDC。cDC1富集于MHC-I介导的抗原呈递，而cDC2则主要促进免疫激活。
3.9. 巨噬细胞向促炎M1表型极化
巨噬细胞被分为13个簇，主要归类为促炎的M1型和抗炎的M2型。在8周组，M1巨噬细胞显示出抗原呈递和炎症活性。令人意外的是，在组织损伤严重的16周组，M1巨噬细胞反而表现出免疫耐受通路的激活，可能是一种限制免疫病理的负反馈机制。
3.10. 甲状腺滤泡细胞的转录异质性和拟时序分析
对甲状腺滤泡细胞进行亚群分析，识别出14个簇，并根据功能和免疫相关基因表达注释为6个功能亚型：成熟甲状腺滤泡细胞、抗原呈递甲状腺滤泡细胞、炎症性甲状腺滤泡细胞、应激性甲状腺滤泡细胞、结构性甲状腺滤泡细胞和周期循环甲状腺滤泡细胞。随着疾病进展，抗原呈递型和炎症型甲状腺滤泡细胞显著扩张，而成熟型细胞比例下降，且“甲状腺激素代谢过程”通路被显著下调，表明甲状腺功能广泛受损。拟时序轨迹分析揭示了甲状腺滤泡细胞从根状态（State 1， 主要为成熟和应激细胞）分化为两个不同终端命运（State 2和State 3）的过程，慢性应激驱使细胞向炎症/抗原呈递表型转变。
3.11. 甲状腺基质微环境失调
非甲状腺滤泡区的转录谱分析显示微环境广泛失调。例如，成纤维细胞富集了炎症通路，内皮细胞的血管生成通路被下调，上皮细胞的免疫和转移相关信号被上调，这些都加剧了局部自身免疫反应并阻碍了组织修复。
讨论与结论
本研究通过构建NOD.H-2h4小鼠模型的单细胞转录组图谱，揭示了在疾病进展中甲状腺细胞与免疫细胞之间潜在的复杂相互作用。核心发现包括：
- 1.
甲状腺滤泡细胞的可塑性：慢性应激诱导甲状腺滤泡细胞获得炎症和抗原呈递表型，其身份关键调控因子Nkx2-1活性下调，功能受损。
- 2.
关键的细胞间通讯轴：研究推断出App-Cd74是连接甲状腺滤泡细胞/基质细胞与抗原呈递细胞的新信号轴，其强度与疾病严重程度正相关。该轴可能通过激活APC，进而通过MHC通路激活T细胞，形成一个多细胞级联信号放大机制，驱动自身免疫攻击。
- 3.
T细胞库重塑与Treg功能障碍：浸润的T细胞向细胞毒性效应表型（如Th1、CD8+CTL）倾斜。尽管Treg数量增加，但其关键的Foxp3通路及相关转录因子（如Ets1）活性下降，导致其免疫抑制功能衰竭，无法有效控制炎症。
- 4.
异位胸腺的存在：研究在甲状腺旁鉴定出具有功能的异位胸腺组织，这在NOD背景小鼠中是常见现象，为理解局部免疫环境提供了新维度。
- 5.
基质微环境失调：成纤维细胞、内皮细胞等非免疫细胞也发生了显著的促炎和功能障碍性转录重编程，共同塑造了致病的组织微环境。
综上所述，这项研究系统描绘了自身免疫性甲状腺炎动态演进的细胞和分子图谱，提出了甲状腺滤泡细胞转录可塑性和Treg功能不稳定是驱动疾病进展的潜在机制，并揭示了App-Cd74轴作为一个有待深入验证的新信号通路。这些发现不仅为理解HT的发病机制提供了宝贵的基础数据和新的理论视角，也为未来开发针对特定细胞状态或信号通路的干预策略（如恢复Treg功能或阻断致病性细胞间通讯）指明了潜在方向。
