利用器官诱导潜能干细胞与辅助性间充质细胞群在体外培养系统中实现功能完全的毛囊器官再生

《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Fully functional hair follicle organ regeneration using organ-inductive potential stem cells with an accessory mesenchymal cell population in an in vitro culture system

本研究针对成年生物毛囊再生所需的最小细胞单位及其机制尚不明确的问题，开展了利用器官胚方法在体外重建功能性毛囊的研究。研究者通过结合毛囊隆突区来源的上皮干细胞、真皮乳头细胞以及鉴定出的PDGFRα+/Sca1+/CD34high+间充质细胞群，成功在体外三维培养体系（含人工皮肤模型）中实现了具有向下生长、完整毛囊再生及毛发周期循环等功能的全功能毛囊器官再生，为理解成体器官诱导潜能干细胞及其微环境在器官形态发生和再生中的作用提供了重要依据。

　　

毛发不仅能御寒防晒，更是个人形象与健康的重要标志。然而，脱发、秃顶等问题困扰着全球数以亿计的人群。传统的药物治疗或毛发移植，或效果有限，或“拆东墙补西墙”，难以实现真正的毛囊新生与长期维持。在自然界，毛囊是少数能在成年生物体内进行周期性再生（即毛发周期）的器官，这为我们提供了研究器官再生的绝佳模型。毛囊的再生依赖于其内部复杂的“生态系统”，包括上皮干细胞、真皮乳头细胞以及多种间充质细胞。尽管先前研究已成功利用上皮干细胞和真皮乳头细胞在体内再生出毛囊，但在完全脱离生物体环境的体外培养系统中，仅凭这两种细胞无法实现毛囊的完整向下生长和毛发周期。究竟还需要哪些关键的“辅助细胞”参与？这些细胞如何在体外驱动毛囊的形态发生和周期性再生？这些问题成为实现功能性毛囊体外再生的关键瓶颈。为了回答这些问题，RIKEN（日本理化学研究所）再生器官实验室的研究团队在《Biochemical and Biophysical Research Communications》期刊上发表了一项突破性研究。

为了开展这项研究，研究人员主要运用了以下几项关键技术方法：首先，他们采用了其团队开发的“器官胚方法”，这是一种三维细胞操作技术，用于高密度、分区室化地重组不同来源的细胞。其次，利用从成年小鼠触须（vibrissa）毛囊中分离和培养的隆突区（bulge）上皮干细胞、真皮乳头（DP）细胞，以及从背部有毛皮肤（pelage）分离的真皮来源间充质细胞（DDMCs）或触须毛囊隆突周围间充质（ABM）细胞。再者，建立了体外三维器官培养系统，并优化了培养基条件（如干细胞培养基与成熟培养基的两步培养法）。此外，还构建了包含毛囊的3D皮肤等效物模型，用于模拟皮肤内环境。研究中也综合运用了流式细胞术分选特定细胞亚群（如PDGFRα⁺/Sca1⁺/CD34^high+细胞）、实时活细胞成像分析细胞动力学、以及多种分子生物学和组织学分析技术（如qPCR、免疫组化、透射电镜等）来表征再生毛囊的结构与功能。

研究结果

3.1. 生物工程毛囊的体外再生

研究者首先发现，仅由胚胎皮肤细胞或成年触须来源的上皮干细胞和DP细胞重组的毛囊胚，在体外培养中只能形成毛球，无法完成向下生长和毛干伸长。然而，当在毛囊胚底部额外高密度添加来自成年小鼠有毛背部皮肤的新鲜真皮来源间充质细胞（F-DDMCs）作为第三层细胞时，生物工程毛囊成功实现了包括向下生长、毛干伸长和脂肪细胞生成在内的完整再生。分子表达分析显示，再生毛囊发育过程中关键基因的表达模式与天然毛囊相似，且再生的毛干在超微结构上与天然触须毛干一致。

3.2. 支持毛囊发生和毛发生长的新鲜DDMCs的群体和功能特征

通过比较不同来源的间充质细胞（如腹股沟或性腺周围脂肪来源的干细胞），发现只有来自有毛皮肤皮下的F-DDMCs能有效促进生物工程毛囊的向下生长、毛干产生和周围脂肪细胞分化。免疫组化分析揭示了这些DDMCs在再生毛囊中分化成了表达PDGFRα、Sca1、CD34、αSMA等标记的细胞，并定位于毛囊最外层的结缔组织鞘（CTS）区域。流式分选实验进一步将具有促向下生长功能的细胞群体精确锁定为PDGFRα⁺/Sca1⁺/CD34^high+的间充质细胞。

3.3. 生物工程毛囊和3D皮肤器官系统的功能性再生

研究团队成功构建了包含生物工程毛囊的3D皮肤等效物。在此模型中，再生的毛囊不仅结构完整，还能自发地经历生长（生长期）和退化（休止期）的周期性循环，即再现了毛发周期。平均生长和回归周期与天然毛囊相近。此外，将该3D皮肤等效物移植到裸鼠背部后，毛囊能够继续生长毛发并维持周期循环，且移植的皮肤实现了神经支配和立毛肌连接，展现了完整的皮肤功能。

3.4. 具有完全毛囊再生和向下生长支持功能的间充质细胞的培养与鉴定

研究人员建立了DDMCs和ABM细胞的体外培养方法，获得的培养后细胞（C-DDMCs/C-ABM）仍保持PDGFRα⁺/Sca1⁺/CD34^high+表型，并保留支持毛囊向下生长的能力。活体成像显示，这些培养的间充质细胞贡献于CTS的形成，分化成毛囊鞘（DS）细胞，并包绕毛囊外根鞘（ORS）生长。来自触须毛囊隆突周围间充质（ABM）的细胞也表现出相似的功能和表型。

3.5. 生物工程毛囊细胞动力学分析

通过对再生毛囊进行活细胞成像和三维分析，研究人员揭示了向下生长阶段的细胞运动模式：外根鞘（ORS）细胞在CTS的支持下向毛囊底部方向运动，而内根鞘（IRS）和毛干细胞则向上移动。基因表达分析显示，培养的ABM细胞高表达与细胞骨架和平滑肌收缩相关的基因（如Acta2、Tagln等），提示它们可能通过提供机械支撑和收缩力来协助毛囊的形态建成和向下生长。

结论与讨论

本研究成功地鉴定出能够在体外自主生成全功能毛囊器官的最小细胞单元，即由成年小鼠毛囊隆突区来源的上皮干细胞、真皮乳头（DP）细胞以及来自皮肤真皮或毛囊隆突周围的PDGFRα⁺/Sca1⁺/CD34^high+间充质细胞（DDMC/ABM细胞）三者共同构成的组合。DDMC/ABM细胞通过分化为毛囊鞘（DS）细胞并形成结缔组织鞘（CTS），不仅诱导了毛囊向下生长并进入生长期后期，还驱动了毛囊在体外培养中重复的周期循环。

这项研究的意义重大。首先，它首次在完全脱离生物体的体外培养系统中，仅用三种明确区室化的成体细胞，实现了具有完整结构和周期性再生功能的毛囊重建，这为毛囊发育生物学和再生医学研究提供了一个强大的体外模型。其次，研究鉴定出的PDGFRα⁺/Sca1⁺/CD34^high+间充质细胞群，是驱动毛囊向下生长和周期循环的关键“辅助细胞”，加深了我们对毛囊微环境中不同细胞群体（干细胞、诱导细胞、辅助细胞）相互作用的理解。这些发现不仅限于毛囊，对于理解其他器官的发育、干细胞生态位的建立以及程序性器官再生都具有普遍的启示意义。该研究为未来开发基于细胞疗法的人类毛囊再生策略、构建更仿生的人工皮肤模型以及筛选促毛发生长药物奠定了坚实的科学基础。