《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Lamin B receptor upregulation in metastatic melanoma causes nuclear envelope fragility in confined migration during cancer invasion
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这篇研究揭示了转移性黑色素瘤中核膜脆弱性的新机制。作者发现，在空间受限的迁移过程中，核膜破裂是恶性肿瘤细胞（如黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌细胞）的固有属性，这会引发可遗传的DNA损伤，加剧疾病侵袭性。其核心机制在于肿瘤细胞中核内膜蛋白Lamin B受体（LBR）的转录上调，它通过其固醇还原酶活性增加了细胞胆固醇水平，从而增加了核的可变形性和脆弱性，最终在受限条件下导致核膜破裂，促进肿瘤转移，并与患者较差的预后相关。这项研究将LBR确立为预防黑色素瘤转移的潜在治疗靶点。
NE相关基因在癌症进展中转录改变，促进NE脆性
研究首先探究了癌症中核膜相关基因表达是否普遍改变，以及这是否与NE脆性和核力学特性相关。对来自癌症基因组图谱（TCGA）泛癌数据库的10种癌症亚型的6,860个临床样本分析显示，249个NE基因的表达失调广泛存在于多种癌症中。为了验证这些转录变化是否与NE脆性相关，研究者使用了聚二甲基硅氧烷细胞限制装置模拟体内组织的空间限制条件，并在表达两种NE脆性生物传感器的细胞中进行了测试。其中，mCherry融合核定位信号（mCherry-NLS）用于评估NE通透性的微小改变，GFP标记的环状GMP-AMP合酶用于检测大规模NE破裂导致的染色质泄露。结果显示，恶性黑色素瘤、乳腺癌和前列腺癌细胞在3 μm的受限高度下，与对应的良性细胞相比，表现出显著更高的NE破裂频率，表明NE相关基因失调和受限条件下NE脆性增加是恶性细胞的普遍内在属性。透射电镜观察也发现，与良性黑色素细胞中均匀的~45 nm核膜间距相比，黑色素瘤细胞的核膜间距表现出4-177 nm的不一致性。
NE和膜相关基因在黑色素瘤疾病进展中转录上调
为了确定NE基因的转录改变如何介导癌症中NE脆性的变化，研究者聚焦于黑色素瘤。对BRAFV600E黑色素瘤临床样本的单细胞和批量RNA-seq转录组学数据进行荟萃分析，揭示了从良性痣到转移性黑色素瘤的明确转录进化。从患者活检组织和细胞系中交叉比对，鉴定出3,253个在良性和转移性黑色素瘤间表达显著差异的候选基因。基因本体富集和功能注释聚类分析显示，核质和膜相关基因显著富集。有趣的是，几乎所有与核相关的基因在转移性黑色素瘤中均上调，而LINC复合体成分nesprin-1和nesprin-2显著下调。这些结果表明，与侵袭性黑色素瘤相关的核及NE异常，与患者肿瘤活检组织中核基因的上调相关。
LBR上调是促进NE脆性和核可变形性的必要且充分条件
接下来，研究试图确定核相关基因的转录调控是否会改变癌症进展中的NE脆性。从生物信息学分析中排名前30的上调NE基因中，研究者选取了一个高优先级子集，并利用小干扰RNA（siRNA）降低其表达，包括Lap2β、emerin、Lamin B2、Nup93、CHMP2A和Lamin B受体。将这些siRNA与mCherry-NLS或GFP-cGas共转染细胞，并对其在3 μm限制下的NE脆性标志物进行量化。结果显示，降低LaminB2或LBR的表达几乎完全消除了NE破裂。Western印迹证实，LBR在黑色素瘤细胞（1205Lu）中的丰度比永生化黑色素细胞高30%，而敲低LBR可将其水平降至与黑色素细胞相似的水平。重要的是，在LBR敲低的细胞中重新表达mCherry-LBR，可以将限制诱导的cGas灶频率恢复至对照水平。反之，在良性黑色素细胞中适度过表达mCherry-LBR，可使NE破裂频率增加3.5倍以上，达到与黑色5Lu细胞相当的水平。这表明黑色素瘤细胞中LBR的上调是促进受限条件下NE脆性所必需的，其过表达足以在良性黑色素细胞中引起NE破裂。
为了探究LBR上调是否影响核的力学特性，研究使用了原子力显微镜和共聚焦显微镜联用技术，以量化整体核刚度并可视化核形状。结果显示，永生化黑色素细胞的核明显比1205Lu黑色素瘤细胞的核更硬。敲低1205Lu细胞中的LBR会导致整体核刚度增加至黑色素细胞水平，而在LBR敲低的细胞中重新表达mCherry-LBR或在黑色素细胞中过表达mCherry-LBR，均可将刚度降低至1205Lu细胞水平。这表明LBR表达增加是导致受限条件下NE破裂以及产生更柔软、可变形性更强细胞核的必要且充分条件。
转移性黑色素瘤中LBR上调导致INM脆弱性
随后，研究试图确定过量LBR导致NE破裂的细胞机制。通过比较野生型和LBR敲低细胞中核纤层、INM、LINC复合体、核孔和浓缩异染色质的免疫染色，发现LBR敲低并未导致这些维持NE结构的蛋白水平发生显著差异。然而，在表达GFP-Lap2β标记INM的活细胞中进行延时成像分析发现，野生型1205Lu细胞在受限时产生的大型核膜泡被内质网/外核膜阳性膜包裹，但INM标记物GFP-Lap2β在其形成位置出现了局部不连续，表明INM发生了断裂。这些外核膜泡逐渐增大并充满mCherry-NLS和染色质，直到外核膜破裂，将核质和染色质释放到细胞质中。相比之下，LBR敲低细胞产生的核膜泡较小，且被INM和外核膜阳性膜同时包裹，常随时间推移而消退，INM和外核膜标志物保持连续。这表明，在黑色素瘤细胞中LBR上调促进了在异染色质耗竭区域形成LBR簇，在受限条件下，INM的局部断裂和压力诱导的泡化最终导致外核膜破裂，将染色质溢出到细胞质。
LBR的固醇还原酶活性促进NE脆性
为了阐明LBR促进NE脆性和核可变形性的分子机制，研究者在LBR敲低的背景下，通过突变体回补实验结合NE破裂和力学分析进行了探究。结果显示，缺乏N端核纤层和染色质直接结合结构域的截短突变体，能够挽救LBR敲低对cGas灶形成和核可变形性的影响。然而，一个导致Greenberg骨骼发育不良、使其固醇还原酶活性丧失的点突变体，虽然能够挽救LBR敲低导致的核软化，却无法挽救NE破裂频率的降低。这表明，LBR的C-14固醇还原酶活性促进了NE脆性，但不影响核可变形性，说明NE脆性和核硬度受LBR在机制上不同的功能调控。
为了探究LBR的固醇还原酶活性如何促进受限条件下的NE脆性，研究者检查了LBR对黑色素瘤细胞胆固醇生物合成的贡献。气相色谱-质谱分析显示，LBR敲低导致细胞中cholesta-8,14-dien-3β-ol中间体积累，表明其酶活性受损。荧光分析显示，LBR敲低显著降低了总细胞胆固醇水平，而用mCherry-LBR（而非固醇还原酶缺陷突变体）回补可恢复胆固醇水平。用甲基-β-环糊精急性消耗胆固醇，或使用临床相关药物辛伐他汀处理，均可使细胞核呈现更强的可变形性，并显著降低GFP-cGas灶的发生率，与LBR敲低效果相似。因此，黑色素瘤疾病进展中LBR的上调通过增加细胞胆固醇水平来驱动受限条件下的NE脆性，而降低胆固醇水平足以消除这种效应。
LBR在肿瘤类器官的受限迁移中促进侵袭和NE破裂
研究者进一步在体外肿瘤类器官模型中考察了LBR在NE脆性和黑色素瘤侵袭中的作用。将稳定表达GFP-cGas和mScarlet-NLS的1205Lu细胞嵌入提供限制性细胞外基质的3D胶原基质中生长一周。分析显示，与对照组相比，LBR敲低显著降低了从类器官脱落并侵入细胞外基质的细胞数量，以及它们从类器官中心迁移的距离。尽管高细胞密度妨碍了对类器官核心区NE破裂的准确测量，但对类器官边缘外侵入性细胞的量化显示，许多野生型或非靶向对照细胞在侵入细胞外基质时显示出GFP-cGas灶，而LBR敲低的侵袭性细胞中NE破裂显著减少。与GFP-cGas灶相关的细胞核，其最小直径明显小于无灶细胞核，表明破裂发生在遭受细胞外基质或其他细胞限制的细胞核中。这些结果表明，LBR转录上调促进了黑色素瘤类器官中细胞侵袭的增加，并在侵袭性细胞中引发了NE破裂。
LBR上调在体内促进黑色素瘤侵袭并与患者较短的无病生存期相关
最后，研究通过在Foxn1nu小鼠皮下注射表达LBR或非靶向短发夹RNA以及生物传感器的1205Lu细胞，构建了体内黑色素瘤模型。肿瘤生长两个月后，高分辨率双光子成像显示，在所有实验条件下均观察到显著的细胞外基质重排和黑色素瘤细胞迁移。与对照组相比，LBR敲低肿瘤内部的细胞密度显著降低。尽管组织深处背景荧光等因素限制了所有带有核周GFP-cGaS灶细胞的精确量化，但观察到与GFP-cGas灶相关的细胞核主要出现在肿瘤外围，尤其是在通过致密胶原转移的细胞中，且对照肿瘤中的核破裂似乎比LBR敲低肿瘤更频繁。带有cGas灶的细胞核的最小半径显著小于无灶细胞核，与条件无关，这意味着NE破裂发生在体内经历限制的细胞中。对患者生存数据的分析发现，虽然LBR水平与所有分期肿瘤或继发性肿瘤样本的无病生存期无显著相关性，但在原发性黑色素瘤中，LBR上调预示着显著降低的生存率。这些数据共同证明，在BRAFV600E黑色素瘤中，过量的LBR促进了肿瘤生长和侵袭，并在侵袭性的受限转移迁移过程中驱动NE脆性和核可变形性，如果在黑色素瘤发展早期上调，则与患者较差的预后相关。
讨论
这项研究对良性和恶性癌细胞中反复出现的转录变化和细胞限制实验进行了系统分析，发现NE基因上调和NE脆性增加是三种癌症亚型从良性发展到转移的内在属性。利用生物信息学方法聚焦黑色素瘤，研究发现核质、囊泡和细胞器膜基因的上调标志着黑色素瘤从良性痣向转移性发展。基于限制的siRNA筛选确定LBR上调是促进黑色素瘤NE脆性和可变形性增加的必要且充分条件。活细胞成像显示，NE破裂通过一个三步细胞机制发生：首先，LBR上调驱动其在INM中聚集，导致INM破裂；然后，限制的压力将核质和染色质挤入一个大型外核膜泡中；最终，外核膜泡破裂，导致核质溢出，染色质暴露于细胞质，从而增加了DNA损伤的可能性。分子机制研究表明，LBR的固醇还原酶活性有助于产生过量的细胞胆固醇，而该活性是促进受限条件下INM脆弱性的原因。对黑色素瘤侵袭的生理模型分析表明，LBR表达促进了通过限制性细胞外基质的侵袭增加，在那里细胞遭受限制和核变形，导致NE破裂。因此，黑色素瘤疾病进展中LBR的上调，通过其在胆固醇生物合成中的酶促作用，导致NE脆性增加，从而促进转移性侵袭。
