《Bioconjugate Chemistry》：Development and Optimization of an Aminooxy Coupling Reaction to Prepare Multivalent Bioconjugates with a Single Noncanonical Amino Acid
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为了克服传统生物偶联方法选择性差、难以实现多价功能化的局限，研究人员优化了一种新型的生物正交反应。他们利用基因密码扩展技术，通过铜催化的Glaser–Hay偶联与后续的氨基氧基对1,3-二炔的无试剂加成，实现了从单一非经典氨基酸出发，在蛋白质上高效、特异地引入两种不同功能分子。该方法成功构建了集靶向、治疗（MMAE）与示踪（荧光探针）功能于一体的三价抗体药物偶联物（ADC），在HER2+细胞中展现出高特异性与高效力，为开发多功能诊断和治疗性生物偶联物提供了新策略。
生物分子如同生命体内的精密机器，而科学家们一直希望能给它们装上更多功能“外挂”，使其不仅能识别病灶，还能精准投递药物、实时报告行踪。这种给蛋白质“加装”其他功能分子的技术，被称为生物偶联。它在疾病诊断、成像和治疗，尤其是近年来大热的抗体药物偶联物（ADC）领域扮演着关键角色。然而，传统的偶联方法面临巨大挑战：蛋白质上可反应的天然氨基酸（如赖氨酸、半胱氨酸）位点太多，导致连接位置和数量难以精确控制，好似在布满按钮的面板上随机操作，最终得到的“产品”成分混杂不均，这不仅影响药物剂量，还会改变其稳定性和药效。
为了解决这一“随机连接”的难题，科学家们转向了生物正交化学。其核心思想是：先通过基因工程，在蛋白质的特定位点“安装”一个自然界蛋白质不携带的、独特的化学反应“把手”——非经典氨基酸（ncAA），然后利用只与该“把手”发生反应，且不干扰生命体系正常运行的化学方法进行偶联。这为精准、均一的生物偶联提供了可能。但另一个更高阶的挑战随之而来：如何在仅使用一个“把手”的情况下，实现多种功能分子的同步连接，即构建多价生物偶联物？例如，能否在一个抗体上同时连接抗癌药物和荧光探针，打造出“治疗+示踪”一体化的智能导弹？
针对这一前沿需求，一篇发表在《Bioconjugate Chemistry》上的研究为我们带来了创新的解决方案。该研究开发并优化了一种新的级联生物正交偶联策略，仅需使用一种含有末端炔烃的非经典氨基酸作为起点，就能高效、特异性地在蛋白质上安装两种不同的功能分子，成功制备出功能强大的三价生物偶联物。
作者主要运用了以下几个关键技术方法：首先，利用基因密码扩展技术，在目标蛋白的特定位点（如GFP的151位点、抗HER2-Fab的202位点）定点嵌入含炔基的非经典氨基酸p-丙炔氧基苯丙氨酸（pPrF），这为后续反应提供了独特的反应位点。其次，采用铜(I)催化的Glaser–Hay生物正交偶联反应，将带有炔基的小分子“伙伴”连接至蛋白质的pPrF位点上，生成一个关键的1,3-二炔中间体。最后，无需任何额外催化剂，该1,3-二炔中间体可与商业易得的O-烷氧基胺功能分子（如氨基氧基荧光探针）高效反应，完成第二个功能分子的引入。研究还优化了反应条件，实现了上述两步反应在“一锅法”中进行，简化了流程。实验验证部分使用了人乳腺癌细胞系（如HER2阳性的BT-474细胞）来评估所构建三价ADC的靶向性和杀伤效果。
研究结果
Development and Optimization of Multivalent Bioconjugations
研究人员以绿色荧光蛋白（GFP）为模型系统进行概念验证。首先，通过基因密码扩展技术，在GFP第151位点嵌入了含炔基的非经典氨基酸pPrF。纯化后，在CuI/TMEDA催化下，与生物素炔烃进行Glaser–Hay偶联，成功制备了GFP-生物素二价偶联物，并通过链霉亲和素结合实验证实了偶联成功。随后，他们发现该偶联物中的1,3-二炔结构可与氨基氧基荧光探针（AlexaFluor 488 aminooxy）高效反应，无需任何金属催化剂，在30分钟内即可近乎定量地生成三价偶联物（GFP-生物素-荧光素）。质谱和对照实验（如未形成二炔的GFP-pPrF无反应）均证实了反应的特异性和产物均一性。pH筛选实验表明该反应在pH 6-8范围内均有良好耐受性。
One-Pot Cascade Reaction Optimization
为了提升方法的实用性，研究人员尝试将两步反应整合到“一锅”中进行。他们优化了反应时间、试剂化学计量比和浓度等变量。实验发现，在Glaser–Hay反应进行4小时后，直接加入氨基氧基荧光探针继续反应，在炔烃伙伴与氨基氧基伙伴以1:3摩尔比、且浓度加倍的最优条件下，可高效（>90%）生成三价偶联物，并通过凝胶电泳和链霉亲和素珠结合实验得到了验证。这避免了中间体的纯化步骤，简化了多价偶联物的制备流程。
Application to Antibody–Drug Conjugates
为了展示该方法在治疗应用中的潜力，研究人员将其应用于构建三价抗体药物偶联物。他们选取了靶向HER2（人表皮生长因子受体2）的曲妥珠单抗抗原结合片段（anti-HER2-Fab）作为载体，在其第202位丝氨酸位点嵌入pPrF。起初使用甲氨蝶呤（MTX）炔烃衍生物进行偶联，构建的ADC在HER2阳性细胞中未显示活性。随后，他们将细胞毒性载荷换为更高效的单甲基奥瑞他汀E（MMAE），并通过级联反应同时连接了MMAE-炔烃和氨基氧基荧光探针，成功构建了三价抗HER2-Fab-MMAE-荧光素偶联物。实验证明，该三价偶联物能特异性结合HER2蛋白，并在HER2阳性的BT-474乳腺癌细胞中展现出纳摩尔级（EC50约2.72 nM）的强大细胞杀伤活性，而对HER2阴性的HeLa细胞则无明显毒性。同时，荧光显微镜成像清晰地显示了该偶联物在BT-474细胞表面的快速定位（15分钟内）、后续的内化过程以及最终导致的细胞死亡（约8小时后），实现了治疗过程的实时示踪。
结论与重要意义
该研究开发并优化了一种基于1,3-二炔与O-烷氧基胺反应的新型生物正交偶联方法。该方法与基因密码扩展技术相结合，实现了从单一非经典氨基酸出发，在蛋白质特定位点高效、特异、均一地引入两种不同功能分子，从而制备多价生物偶联物。其核心优势在于：反应快速（<30分钟）、条件温和（生理pH、无需额外催化剂）、产率高、产物稳定，且可实现“一锅法”操作。
研究最重要的实践意义在于，成功构建并验证了一种集靶向（抗HER2-Fab）、治疗（MMAE）与实时示踪（荧光探针）功能于一体的三价抗体药物偶联物。该“三合一”智能药物在细胞实验中表现出高特异性、高效力和可追踪性，证明了该方法在开发下一代多功能诊疗一体化生物偶联物方面的巨大潜力。这项工作不仅扩充了生物正交反应的化学工具箱，也为制备结构明确、功能增强的均质化治疗和诊断试剂提供了创新且通用的平台策略，预示着在精准医学和药物递送领域广阔的应用前景。
