《Bioconjugate Chemistry》：Multimeric Branched and Hyperbranched Peptide Ligands of the Natural Cytotoxicity Receptor NKp30 on Natural Killer Cells
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本研究为解决传统方法难以实现对转录因子(TF)活性进行时空精确调控的难题，通过理性设计并合成了在关键位点(如Lys31/57)掩蔽了光响应基团(o-Nitroveratryloxycarbonyl, Nvoc)的转录因子Max。研究人员利用NCL与Pd介导的C-S交叉偶联的化学合成策略，成功制备了“笼化”的Max蛋白(Max-Nvoc)。该蛋白质在“笼化”状态下DNA结合活性显著降低，而通过简单的原位光解即可在数分钟内实现快速、按需激活，恢复其与增强子盒(E-box)的强效结合能力。这项研究为开发可按需调控基因表达的工具提供了新方法，在基础研究和生物医学应用领域具有重要潜力。
基因表达是生命活动的核心过程之一，而转录因子(Transcription Factors, TFs)则是调控这一过程的“总开关”。它们能够识别并结合特定的DNA序列，从而开启或关闭基因的“朗读”。在人体这个复杂的“调控网络”中，Max蛋白扮演着至关重要的角色。它作为Myc–Max–Mad转录因子系统的一部分，通过与不同的伙伴蛋白结合，影响着约15%的人类基因表达，对细胞生长、增殖和分化进行精密调控。有趣的是，这个系统一旦失调，与近70%的人类癌症密切相关。因此，能够像使用“遥控器”一样，在特定的时间和地点精确控制像Max这样的关键转录因子的活性，无疑将为理解生命过程、开发新型疗法提供前所未有的强大工具。
然而，给蛋白质安装一个可控的“开关”并非易事。传统生物学方法难以在特定位点引入可逆的、能响应外部刺激（如光）的化学修饰。尽管有研究揭示了Max蛋白上特定的赖氨酸(Lys)残基（如Lys31和Lys57）的乙酰化会削弱其DNA结合能力，这启发了科学家模拟这种天然的翻译后修饰(Post-translational Modifications, PTMs)调控机制，但如何将这一原理转化为一个可实际操作的、能被光快速“打开”的合成系统，依然是一个巨大挑战。
正是为了攻克这一难题，来自特拉维夫大学的研究团队在《Bioconjugate Chemistry》上发表了一项创新性研究。他们成功设计并合成了一种光响应的“笼化”转录因子，实现了对Max蛋白DNA结合活性的按需、快速光控激活。
为了开展这项研究，研究人员主要运用了以下关键实验技术：1. 基于Fmoc固相肽合成(Fmoc-SPPS)策略，分段合成目标肽段；2. 采用多肽酰肼法生成肽硫酯，并运用一锅法天然化学连接(Native Chemical Ligation, NCL)技术进行肽段连接；3. 为避免光敏保护基团在传统自由基脱硫反应中分解，创新性地结合了NCL与钯催化的C-S交叉偶联(S-arylation)这一“无脱硫”策略，完成了最终“笼化”蛋白(Max-Nvoc)的合成与纯化；4. 通过紫外光(350/365 nm)照射，在溶液条件下实现Nvoc基团的“去笼化”（光解）；5. 利用凝胶迁移或电泳迁移率实验(Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA)、圆二色光谱(Circular Dichroism, CD)和生物层干涉技术(Biolayer Interferometry, BLI)等多种生物物理方法，系统地表征了蛋白质的二级结构、DNA结合活性及其动力学参数。
结果与讨论
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“笼化”转录因子的设计与合成
研究人员首先确定了Max蛋白DNA结合域中与DNA磷酸二酯骨架形成关键盐桥的两个赖氨酸残基（Lys31和Lys57）作为修饰靶点。他们计划用光敏感的Nvoc基团掩蔽这两个位点。初始尝试采用经典的NCL-脱硫策略，但由于Nvoc基团与自由基脱硫条件不兼容而失败。随后，他们巧妙地转换了连接位点，将连接点设在Phe34，并采用NCL与Pd(II)氧化加成络合物(Pd(II)-OAC)介导的S-芳基化反应相结合的新策略，成功合成了高纯度的目标蛋白Max-Nvoc。这一策略凸显了将蛋白质全合成与晚期转化相结合，以获取传统方法难以制备的新型光反应性蛋白的强大能力。
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“笼化”显著抑制DNA结合活性
合成得到Max-Nvoc后，研究团队通过EMSA实验评估了其与含有经典E-box序列的双链DNA探针的结合能力。结果表明，无论是Max-Nvoc自身形成的同源二聚体，还是其与荧光标记的Myc蛋白(T-Myc)形成的异源二聚体，其DNA结合活性都受到了显著抑制。这种抑制在同源二聚体中更为明显，可能是因为其含有更多的掩蔽基团。抑制作用不仅源于关键赖氨酸残基电荷的中和，也来自庞大的Nvoc基团造成的空间位阻。这些结果证明，设计的“笼化”转录因子有效地“关闭”了Max的DNA结合功能。
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光控“去笼化”与活性恢复
接下来，研究人员优化了在水相缓冲液中对Max-Nvoc进行光解“去笼化”的条件。在含有添加剂（如DTT和甲氧胺盐酸盐）的MES缓冲液中，使用350 nm紫外线照射60分钟，可实现高达99%的转化率，得到“去笼化”的Max蛋白。重要的是，即使在更简单的1× PBS缓冲液中，也能实现高效去笼化。光谱分析显示，“笼化”与“去笼化”后的Max蛋白均保持了正确的α-螺旋二级结构，表明Nvoc基团的引入并未破坏蛋白质的天然折叠。
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“去笼化”恢复类天然DNA结合活性
对“去笼化”后Max蛋白的功能验证是关键。EMSA实验显示，在优化的光照和结合条件下，“去笼化”的Max恢复了强大的DNA结合能力，呈现出清晰的剂量依赖性条带迁移。CD光谱分析进一步证实，只有在“去笼化”后，Max蛋白在加入E-box DNA时才会出现螺旋性显著增加，表明其结构因与DNA结合而稳定。而Max-Nvoc则因结合能力弱，光谱变化很小。更为精确的BLI动力学分析量化了这一变化：Max-Nvoc与E-box DNA的解离常数(KD)高达161 μM，表明结合很弱；而“去笼化”后，KD值恢复至13 nM，这与之前报道的天然Max的亲和力处于同一数量级。最后，研究人员还演示了Max-Nvoc在DNA存在下的原位激活：随着紫外线照射时间的延长（0至70分钟），EMSA中显示的DNA结合活性逐渐增强，这直接证明了在复杂的生物分子环境中也能实现按需的功能激活。
结论与意义
本研究成功构建并验证了一种光响应的“笼化”转录因子Max-Nvoc。通过在其DNA结合的关键残基Lys31和Lys57上引入光敏感的Nvoc保护基团，实现了对其DNA结合活性的有效抑制（“关闭”状态）。更重要的是，通过简单的紫外线照射，可以在数分钟内实现位点选择性的“去笼化”，迅速恢复其类天然的、强效的DNA结合能力（“开启”状态）。
这项工作的意义在于：首先，它提供了一种在蛋白质水平对转录因子活性进行精确时空调控的新策略，模仿了自然的PTMs调控逻辑，但赋予了外部光控的“开关”能力。其次，研究中所开发的“NCL + S-芳基化”合成路线，克服了光敏基团与常规蛋白质合成化学（如自由基脱硫）的不兼容问题，展示了将蛋白质全合成与多样化后期修饰相结合的强大潜力，为合成其他复杂修饰蛋白开辟了新途径。最后，该工作所证明的概念——即通过化学修饰关键相互作用残基来可逆地调控蛋白质功能——具有普适性，不仅限于Max蛋白或转录因子，未来可扩展到其他重要的信号蛋白或酶，用于基础生物学机制研究和开发新型光控治疗工具。当然，要将这种控制水平应用于复杂的生物体系，未来还需要开发生物相容性更好的光裂解保护基团。这项研究为实现对生命核心调控元件的精准、远程操控迈出了坚实的一步。
