《Biologicals》：Oral immunization with engineered probiotics expressing tcdB protects mice against
Clostridioides difficile infection
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利用工程益生菌乳酸乳杆菌NM0323和肠球菌NM0423表达艰难梭菌毒素B的C末端域，通过小鼠口服免疫和挑战实验，证实其能有效降低艰难梭菌载量、抑制毒素A表达并维持肠道完整性，同时激发血清IgG/IgA/IgM免疫应答，为CDI预防提供新策略。
作者：May M.A. Bahr、Marwa T. ElRakaiby、Abd El-Nasser A. Madboli、Nahla M. Mansour
研究机构：埃及国家研究中心，天然与微生物产品化学系，制药与药物工业研究所，地址：El Bohouth街33号，Dokki，邮政信箱12622，开罗
摘要
艰难梭菌（Clostridioides difficile，简称CDI）感染是一个全球性的健康问题，其主要致病因素是毒素A（TcdA）和毒素B（TcdB）。针对这些毒素的疫苗接种，尤其是通过口腔黏膜途径进行接种，被认为是一种有前景的预防策略。本研究探讨了经过基因工程改造的益生菌乳杆菌（Lactobacillus gasseri）NM0323和粪肠球菌（Enterococcus faecium）NM0423作为口服疫苗载体的有效性，这些益生菌表达了tcdB基因的C端结构域。
实验中，小鼠通过口服方式接受免疫接种，并在随后接受艰难梭菌感染。定量PCR分析显示，与对照组相比，接种组中的艰难梭菌数量显著减少，< />A基因的表达也明显降低。此外，组织病理学和免疫组化分析表明，接种组小鼠的肠道完整性得以保持，且毒素A的反应性极低。免疫学评估还显示，接种组小鼠的血清IgG、IgA和IgM水平升高。
这些发现强烈支持经过基因工程改造的乳杆菌和粪肠球菌作为有效的口服疫苗载体的潜力，可用于预防艰难梭菌感染，并可能适用于其他肠道病原体的预防。
引言
艰难梭菌感染（CDI）通常发生在广谱抗生素治疗之后，或者由于正常肠道微生物群失衡（菌群失调），导致艰难梭菌大量繁殖并引发疾病。美国疾病控制与预防中心（CDC）将艰难梭菌列为主要的“紧急威胁”病原体之一，需要立即采取严肃措施[1]。艰难梭菌感染对健康构成严重风险，尤其是对老年人而言，甚至可能致命[2]。初次感染后，25-30%的患者会出现复发，第三次感染后这一比例上升至60%[3,4]。艰难梭菌通过释放两种关键毒力因子——毒素A（TcdA）和毒素B（TcdB）来引发疾病[5]。目前常用的治疗手段是口服抗生素，如万古霉素、甲硝唑或菲达莫辛，成功率在64%到82%之间[6,7]。然而，口服抗生素不仅价格昂贵，还可能促进耐药菌株的产生，并破坏正常的肠道微生物群[6,8]。
近年来，粪便微生物群移植（FMT）在临床实践中被广泛用于治疗复发性
艰难梭菌感染，其成功率在60%到90%之间[9,10]。不过，FMT存在高昂成本和感染风险等缺点[11,12]。益生菌通过增强肠道免疫力及恢复肠道微生物群平衡，成为另一种应对
艰难梭菌感染的方法[13,14]。益生菌被定义为在适当剂量下能给宿主带来健康益处的活微生物[15]。有研究建议在住院患者接受抗生素治疗期间常规使用益生菌，以预防
艰难梭菌感染[16]。
在之前的研究中，分离出了三种新型益生菌菌株，分别为
粪肠球菌 NM815、
粪肠球菌 NM915和
粪肠球菌 NM1015，它们均在体外和体内表现出抑制
艰难梭菌的能力[17]。开发针对
艰难梭菌毒素的疫苗是一种有前景的预防方法。毒素A（TcdA）和毒素B（TcdB）具有作为疫苗候选物的潜力[18]。一项研究利用DNA疫苗技术筛选了
艰难梭菌毒素A和B的不同片段的免疫原性[19]；另一项研究则展示了通过黏膜途径递送毒素A重复结构域来设计有效疫苗的可能性[20]。口服抗原递送方式模拟了自然感染途径，可能实现更有效的免疫反应[21]。此外，大规模口服接种相对经济实惠，且通常能同时引发局部和全身免疫反应，有助于清除病原体[22]。此外，经过基因工程改造的益生菌能够表达异源抗原，调节宿主免疫系统，并安全定植于黏膜部位[23,24]。
因此，益生菌为
艰难梭菌感染的口服疫苗提供了有吸引力的选择。在之前的研究中，我们改造了活益生菌菌株，使其表达来自产毒
艰难梭菌菌株ATCC 43255（VPI 10463）的TcdB变体的C端结构域中的无毒受体结合片段（由重复寡肽组成的CROP区域，约包含最后600个氨基酸）。这一C端片段在多种TcdB变体中高度保守，适合作为广泛覆盖
艰难梭菌感染的疫苗抗原目标[25]。
本研究的主要目的是评估经过基因工程改造的乳杆菌 NM0323和粪肠球菌 NM0423作为口服疫苗载体的效果，以潜在地减少和预防艰难梭菌感染的发生。
材料与方法
本研究在小鼠模型中评估了改造菌株与原始益生菌菌株对艰难梭菌的保护效果。
小鼠存活分析
在整个实验期间，每天监测小鼠的体重和临床症状，记录并评分腹泻、毛竖立、活动减少和体重下降等病症。腹泻根据粪便性状和肛门周围染色情况评估，体重下降以基线值的百分比变化表示。收集了所有主要指标（包括存活率、体重和临床评分）的个体数据，以便进行有意义的统计分析。
讨论
艰难梭菌感染通常由摄入耐药性孢子引起，但肠道内原有的健康微生物群可提供天然屏障，防止艰难梭菌定植[33]。由于艰难梭菌的定植、孢子形成以及抗生素使用导致的频繁复发，该病的治疗颇具挑战性[34]。使用甲硝唑和万古霉素治疗艰难梭菌感染存在复发风险，而菲达莫辛则价格较高[35]。
结论
本研究表明，经过基因工程改造的乳杆菌 NM0323和粪肠球菌 NM0423菌株通过表达艰难梭菌 tcdB基因的非毒性片段，显示出对艰难梭菌感染的良好保护作用。这些菌株通过恢复肠道微生物群和减少艰难梭菌的数量，有效保护肠道组织免受损伤。此外，它们还能诱导全身免疫反应，有助于控制艰难梭菌感染。
作者贡献声明
May M.A. Bahr：撰写初稿、数据可视化、方法设计、资金筹集、数据分析。
Marwa T. ElRakaiby：审稿与编辑、撰写初稿、指导工作、数据分析。
Abd El-Nasser A. Madboli：审稿与编辑、撰写初稿、数据可视化、方法设计、数据分析。
Nahla M. Mansour：审稿与编辑、撰写初稿、结果验证、项目管理、资金筹集、数据分析。
伦理声明
无。
数据可用性
本研究生成或分析的数据已包含在手稿中。
资金支持
本研究所需资金由埃及国家研究中心提供（项目编号：2-3-15）。
利益冲突声明
作者声明不存在任何财务或非财务利益冲突。
