《Biomedicine & Pharmacotherapy》：The role of NETO2 in neurological disorders and cancer: From molecular function to clinical relevance
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本文探讨了针对幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, Hp）感染的新型非抗生素疗法。由于Hp抗生素耐药性加剧，传统疗法疗效下降，作者提出了一种创新的免疫调节策略。该研究设计并合成了载有牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis）BCG（具有免疫调节特性）的壳聚糖（Chitosan, CHI）微颗粒（Microparticles, MPs）。微颗粒经过N-Z酰-D-葡糖胺（G MPs）或Pluronic F127（P MPs）修饰，分别靶向胃或肠道释放分枝杆菌，以调动黏膜免疫系统。在豚鼠（Cavia porcellus）模型中，口服接种这些微颗粒后，通过定量聚合酶链反应（qPCR）证实，其能够减少Hp在胃中的定植，并通过免疫荧光显示其降低了与Hp附着相关的黏蛋白（MUC5AC）水平。研究发现，预先暴露于微颗粒的动物，其胃黏膜中浸润了多种T淋巴细胞亚群（CD4+、CD8+、Foxp3+调节细胞、初始或记忆淋巴细胞）和嗜酸性粒细胞。这些细胞与细胞因子谱共同塑造了一个更倾向于免疫耐受或免疫调节、而非强效免疫保护的环境，这可能部分归功于壳聚糖的黏膜黏附性、抗菌和免疫调节特性。作者结论认为，载有牛分枝杆菌BCG的壳聚糖微颗粒（G型和P型）是一种有前景的抗Hp新制剂候选物，值得进一步研究。
引言
幽门螺杆菌（Hp）是一种革兰氏阴性杆菌，全球超过半数人口的胃黏膜被其定植。这种感染与胃炎、胃或十二指肠溃疡、胃癌以及可能与冠状动脉疾病等全身性疾病的发展有关。由于Hp能够逃逸宿主免疫机制，且其抗生素耐药性日益严重，加上传统抗生素疗法对肠道菌群的破坏，世界卫生组织（WHO）已将Hp列为12种最关键的耐药细菌之一。因此，开发绕过这些障碍的新型疗法，特别是非抗生素替代疗法，显得尤为迫切。
材料与方法
本研究旨在设计并评估一种新型疗法：载有活牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis）BCG的壳聚糖（CHI）微颗粒（MPs）。牛分枝杆菌BCG是WHO推荐用于预防结核病的疫苗，近年研究发现其具有训练先天免疫细胞、增强其抗异源病原体（包括细菌和病毒）能力的潜力。壳聚糖因其良好的生物相容性、黏膜黏附性和抗菌特性而被选为载体。研究通过喷雾干燥法制备了两种修饰的微颗粒：一种用N-Z酰-D-葡糖胺（Glc-NAc）修饰（G MPs），旨在酸性胃环境中释放分枝杆菌；另一种用Pluronic F127修饰（P MPs），旨在抵抗胃酸，将分枝杆菌递送至肠道（黏膜相关淋巴组织的中心）释放。微颗粒的理化性质、细菌负载和在不同pH下的释放特性均已事先表征。实验选用豚鼠作为模型，因其胃腺体结构与人类相似，且能产生类似的炎症和免疫反应。
动物实验设计
研究将豚鼠分为若干组：仅接种Hp的组；仅接种载有BCG的G MPs、P MPs或两者同时接种（G/P MPs）的组；以及先接种微颗粒、再接种Hp的组。通过口服途径进行接种。在接种后第7天和第28天，收集动物的胃组织和血液样本进行分析。
结果：减少Hp定植与调节黏蛋白
定量PCR（qPCR）结果显示，与仅感染Hp的动物相比，预先接受G/P MPs处理的动物，在感染Hp 28天后，其胃组织中Hp的毒力基因cagA的拷贝数显著降低，接近对照组水平。扫描电镜（SEM）图像也直观展示了Hp定植的减少。免疫荧光分析发现，Hp感染会显著增加胃黏蛋白MUC5AC的水平，这可能为细菌附着提供条件。而在预先接受微颗粒处理的动物中，MUC5AC的水平显著降低，并且与Hp DNA的数量呈强正相关。生物传感器分析进一步证实，牛分枝杆菌BCG可以与MUC5AC结合，这提示分枝杆菌可能通过竞争性结合黏蛋白位点，干扰Hp的初始附着。
结果：胃黏膜免疫细胞浸润特征
组织病理学分析揭示了不同处理组胃黏膜炎症浸润的差异。仅感染Hp的动物主要表现为中性粒细胞浸润。而接受微颗粒（无论是否后续感染Hp）的动物，其胃黏膜则出现了显著的混合性炎症浸润，特点是含有大量嗜酸性粒细胞和淋巴细胞。免疫组化染色定量分析显示：
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总白细胞（CD45+）在微颗粒处理组中数量增加。
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在微颗粒处理组中，初始型白细胞（CD45RA+）的比例显著升高；而仅感染Hp的组中，则以活化/记忆型白细胞（CD45RO+）为主。
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T淋巴细胞分析表明，微颗粒处理显著增加了胃黏膜中CD3+T细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞的浸润。相关性分析发现，在预先接受微颗粒处理再感染Hp的动物中，CD8+T细胞数量的增加与Hp DNA的减少显著相关。
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此外，微颗粒处理还诱导了组织驻留记忆T细胞（CD69+/CD103+）和调节性T细胞（Foxp3+）数量的增加。
结果：局部细胞因子环境
对胃组织匀浆中细胞因子的分析描绘了不同的免疫环境。仅感染Hp的动物，其促炎细胞因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1α（IL-1α）、IL-2、IL-8、IL-12(p40)、IL-17、IL-33和嗜酸粒细胞活化趋化因子（eotaxin）水平显著升高。而在预先接受微颗粒处理再感染Hp的动物中，早期（7天）仅IL-2、IL-33和eotaxin升高，许多其他促炎因子水平与对照组相近；到后期（28天），促炎环境更为缓和。热图分析显示，Hp感染组以TNF-α和IL-12(p40)等促炎因子为主导，而微颗粒预处理组则显示出抗炎细胞因子IL-10水平的升高趋势，表明免疫环境向调节性方向转变。
结果：减轻组织损伤与促进修复
研究进一步评估了组织损伤和修复的标志物。Hp感染会导致氧化应激标志物4-羟基壬烯醛（4-HNE）、髓过氧化物酶（MPO）和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）水平升高，同时血清C反应蛋白（CRP）水平也上升，并伴随细胞凋亡标志物活化的半胱天冬酶-3（CC3）增加。预先给予微颗粒处理，显著降低了这些损伤标志物的水平，同时提高了与组织再生相关的标记物Mcl-1/Bak二聚体和存活蛋白（survivin）的水平。这表明，微颗粒不仅减轻了Hp感染引起的炎症和氧化损伤，还可能促进了胃黏膜的修复过程。
讨论与结论
本研究开发了一种基于壳聚糖微颗粒递送牛分枝杆菌BCG的新型口服免疫调节策略，用于控制Hp感染。其作用机制可能是多方面的：壳聚糖本身的抗菌和黏膜保护特性；分枝杆菌对胃黏蛋白MUC5AC的竞争性结合，可能物理性阻碍Hp定植；最重要的是，分枝杆菌作为强效免疫调节剂，可能“训练”或改变了宿主的黏膜免疫反应。这种改变表现为招募了包括初始T细胞、细胞毒性T细胞和调节性T细胞在内的多种免疫细胞，并塑造了一个以免疫调节和耐受性为特征、而非过度炎症的局部环境。这种环境虽然可能没有产生强烈的杀菌性免疫，但似乎更有利于控制慢性感染、减轻组织损伤并启动修复过程。因此，载有牛分枝杆菌BCG的壳聚糖微颗粒（特别是G型和P型组合使用）代表了一种有潜力的、基于免疫调节原理的抗Hp感染新方法，为应对日益严峻的抗生素耐药性问题提供了新思路。
