《Canadian Journal of Microbiology》：The infection-exclusive proteome of murine extracellular vesicles defines
Klebsiella pneumoniae-induced immune response signatures
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本研究聚焦于细菌感染诊断难题，以机会性病原体肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）为模型，系统分析了感染状态下小鼠血浆来源细胞外囊泡（EVs）的表型特征与蛋白质组重塑。研究发现，虽然EVs的大小和数量在感染前后无显著差异，但其蛋白质组发生了深刻的重编程，揭示了包括纤维蛋白原显著升高在内的核心蛋白质组变化，并鉴定出感染特异性蛋白质组，其蛋白质富集于补体激活、凝血和免疫反应等通路。这些发现不仅阐明了宿主EVs在细菌感染中的动态响应机制，还为开发基于EVs蛋白质特征的细菌感染新型诊断策略提供了关键分子依据。
在微生物与宿主的永恒军备竞赛中，如何快速、精准地诊断入侵者，一直是临床医学面临的严峻挑战。尤其是像肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）这样的机会性病原体，它们常在医院环境中作祟，感染免疫低下人群，且抗生素耐药性问题日益严峻，使得传统诊断方法的时效性和准确性愈发显得捉襟见肘。有没有一种方法，能够像侦察兵一样，深入敌后，捕捉到病原体入侵时在宿主体内留下的独特“指纹”呢？科学家们将目光投向了细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）——这些由细胞释放的纳米级“通信包裹”，穿梭于体液之间，携带并传递着反映细胞状态的关键信息。理论上，感染发生时，宿主细胞释放的EVs其“货物”（特别是蛋白质）组成必然会发生改变，从而可能蕴含指示特定病原体感染的分子特征。然而，这种由细菌感染触发的宿主EVs蛋白质组究竟如何变化，能否从中提炼出可靠的诊断标志物，仍是悬而未决的问题。
为了回答这些问题，由Jennifer Geddes-McAlister团队领导的研究小组开展了一项深入探索。他们利用肺炎克雷伯菌感染的小鼠模型，系统比较了感染与未感染状态下，从小鼠血浆中分离的EVs在物理特性和蛋白质组成上的差异。这项研究的目标非常明确：评估利用感染宿主EVs的蛋白质组作为细菌感染生物标志物的可行性。相关研究成果已发表在《Canadian Journal of Microbiology》上。
为了开展这项研究，研究人员运用了几个关键的技术方法。首先，他们建立了肺炎克雷伯菌的小鼠感染模型，通过心脏穿刺收集血浆样本。随后，使用尺寸排阻色谱法（Size-exclusion chromatography, SEC）从血浆中分离纯化EVs。通过动态光散射（Zetasizer）技术对分离的EVs进行了粒径、分布和数量等表型表征。研究核心采用了基于液相色谱-串联质谱（Liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS）的蛋白质组学技术，对EVs的蛋白质组成进行无标定量的全面分析。最后，利用生物信息学工具（如MaxQuant, Perseus, STRING）对质谱数据进行处理、统计分析和功能注释，以揭示感染引起的蛋白质组变化及其生物学意义。
研究结果
EV size and quantity were maintained during the infectious state (感染状态下EV的大小和数量得以维持)
研究人员首先对感染和未感染小鼠血浆来源的EVs进行了表型分析。通过Zetasizer测量发现，EVs的粒径分布、平均直径以及颗粒总数在感染组与未感染组之间均未出现统计学上的显著差异。此外，Western blot实验验证了EVs标志物补体C4b的存在，确认了EVs的成功分离。这一结果表明，在肺炎克雷伯菌感染的早期（24小时），宿主EVs的物理产量和基本尺寸特征并未发生剧烈改变，暗示感染的影响更可能体现在分子组成层面。
A core proteome across EVs defines immune-associated responses (EVs的核心蛋白质组定义了免疫相关反应)
随后，研究通过质谱蛋白质组学深入分子层面。他们鉴定出了一个由35种蛋白质构成的“核心蛋白质组”，这些蛋白质在感染和未感染状态的EVs中均有检出。主成分分析显示，基于这组核心蛋白质，样本能按感染状态清晰聚类。进一步分析发现，核心蛋白质组中的纤维蛋白原（Fga, Fgb, Fgg）在感染状态下的EVs中丰度显著增加了约2.6倍（p < 0.05）。同时，核心蛋白质组中还包含多种载脂蛋白、免疫球蛋白、血红蛋白等，共同提示了EVs在基础状态下就参与免疫相关功能，并在感染时被进一步激活。
Infection-exclusive proteins define proteome remodeling upon Klebsiella pneumoniaecolonization (感染特异性蛋白质定义了肺炎克雷伯菌定植后的蛋白质组重塑)
更有趣的发现来自“感染特异性蛋白质组”——仅在被感染小鼠的EVs中检测到的43种宿主蛋白质。基因本体（Gene Ontology, GO）分析显示，超过77%的这类蛋白质定位于细胞外膜、血液微粒等EVs相关区域；超过50%的蛋白质功能与免疫应答激活和急性炎症反应相关。通过STRING数据库构建的蛋白质互作网络，将这些感染特异性蛋白质划分为几个功能簇，包括与急性期反应和止血相关的蛋白质簇、与T细胞分化和细胞因子产生相关的蛋白质簇、与补体激活相关的蛋白质簇等。Reactome通路富集分析进一步表明，“配体与清道夫受体的结合与摄取”和“血小板脱颗粒”是其中最显著的通路。这些数据共同描绘了一幅生动的图景：感染时，宿主通过EVs特异地募集和运输一系列蛋白质，协调急性期反应、补体激活和适应性免疫等多个防御环节。
研究结论与讨论
本研究系统地表征了肺炎克雷伯菌感染小鼠模型中血浆EVs的特征，并首次定义了其感染状态下的核心与特异性蛋白质组特征。结论明确指出，尽管感染未改变EVs的宏观物理特性，但却引发了宿主EVs蛋白质组的复杂重编程。这种重编程体现在两个方面：一是核心蛋白质组（如纤维蛋白原）的丰度变化；二是出现了一批感染特异性的蛋白质，它们主要参与补体激活、凝血调节和免疫应答等过程。这些蛋白质特征构成了宿主对肺炎克雷伯菌感染的独特分子签名。
在讨论中，作者客观评价了本研究的价值与局限。其重要意义在于为利用EVs蛋白质组作为细菌感染诊断工具提供了概念验证和潜在的标志物线索，特别是在理解EVs介导的宿主免疫应答机制方面提供了新见解。然而，研究也指出了几个关键局限：首先，未能检测到细菌来源的蛋白质，这对于实现病原体特异性诊断至关重要；其次，鉴定的蛋白质总数相对有限，要开发成稳健的临床检测方案还需要扩大样本量和提高检测深度；再者，使用SEC方法可能难以完全排除脂蛋白的污染（研究中确实检出了多种载脂蛋白）；最后，小鼠模型的结果需要进一步在人体系统中验证。
特别值得关注的是对补体系统的发现。研究在感染特异性蛋白质组中鉴定出补体C4的裂解产物C4b、甘露糖结合凝集素（Mbl1）及其丝氨酸蛋白酶（Masp1）等补体经典途径和凝集素途径的关键成分。这强烈提示EVs在感染过程中可能扮演了“运输车”的角色，将补体成分运送到感染部位，协助识别和清除肺炎克雷伯菌。尽管Western blot证实C4b在未感染样本中也有微量存在，但其在感染状态下的特异性富集，凸显了补体相关通路在抗细菌感染EVs应答中的核心地位。
总而言之，这项研究像一次成功的“分子侦察”，揭示了隐藏在EVs纳米包裹中的感染密码。它不仅增进了我们对宿主-病原体相互作用复杂性的理解，更重要的是，为未来开发基于液体活检（检测血液等体液中的EVs）的快速、精准细菌感染诊断方法铺下了一块关键的理论基石。随着分离技术和质谱灵敏度的不断提升，从这些微小的“通信囊泡”中解读出更完整的病原体故事，并最终应用于临床实践，正逐渐从愿景走向可能。
