《Cancer Letters》：Endogenous inhibitors of PP2A activates oncogenic and DNA damage response kinases in glioblastoma.
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本研究揭示了胶质母细胞瘤(GBM)通过过表达SET、ANP32A和CIP2A等内源性蛋白来抑制肿瘤抑制因子蛋白磷酸酶2A(PP2A)的活性，从而维持致癌信号通路活性和DNA损伤应答能力。研究人员通过CRISPR-Cas9等技术，证明抑制这些蛋白可恢复PP2A活性，阻断关键致癌激酶并破坏DNA修复，进而抑制肿瘤生长并提高放疗敏感性。这一发现为GBM治疗，特别是放疗增敏，提供了新的靶向策略。
胶质母细胞瘤是成人中最常见且最致命的原发性脑癌，以其侵袭性强、极易复发和治疗抵抗性高而著称。传统的治疗手段如手术、放疗和化疗，往往难以根除肿瘤，患者预后极差。这其中，肿瘤细胞的“超强适应性”是关键障碍之一：即便使用靶向特定致癌激酶（一种参与癌症发生的关键酶）的药物，胶质母细胞瘤也能迅速“另辟蹊径”，激活其他备用通路，继续疯狂生长。这种“信号通路的冗余性”使得单一靶点治疗常常碰壁。因此，寻找一种能够同时“掐断”多条肿瘤生长信号、从根本上遏制肿瘤适应能力的治疗策略，成为该领域的迫切需求。
有趣的是，在健康的细胞中，存在着一种名为蛋白磷酸酶2A（Protein Phosphatase 2A， PP2A）的“总开关”，它就像细胞的“守护神”，负责将那些被过度激活的、促进生长的蛋白质“关闭”（即去磷酸化），从而抑制癌症的发生。在许多癌症中，PP2A的功能会因基因突变而丧失。然而，在胶质母细胞瘤中，PP2A的基因本身往往是完整的。那么，肿瘤是如何在PP2A这位“守护神”的眼皮子底下，维持其汹涌的致癌信号呢？这篇发表于《Cancer Letters》的研究为我们揭开了谜底：肿瘤“策反”了细胞内部的“内鬼”——一组被称为PP2A内源性抑制剂（Endogenous Inhibitors of PP2A， EIPs）的蛋白质。
为了解决胶质母细胞瘤如何抑制PP2A并维持其恶性表现的核心问题，研究人员开展了一系列严谨的实验。他们首先在患者肿瘤样本和细胞系中确认了三种关键EIPs（SET、ANP32A和CIP2A）的异常高表达。随后，他们利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，在胶质母细胞瘤细胞系（如U87-MG和患者来源的OSU2细胞）中分别敲除了这些基因，以观察其对PP2A活性、肿瘤生长和放疗敏感性的影响。为了深入了解背后的分子机制，他们采用了基于邻近生物素连接酶（BioID2）的蛋白质组学方法，系统地绘制了PP2A在正常和EIP缺失情况下的“相互作用图谱”，从而鉴定出受EIPs保护的特定致癌激酶和转录因子。此外，研究还结合了包括蛋白质印迹（Western blot）、克隆形成实验、彗星实验（COMET assay）、免疫荧光、细胞周期分析以及小鼠颅内荷瘤模型在内的多种体内外功能实验，全面评估了EIP缺失对DNA损伤修复、细胞周期检查点控制以及最终细胞命运（如凋亡、有丝分裂灾难或衰老）的影响。
本研究运用了以下几个关键技术方法： 研究首先利用公共数据库（GTEx, TCGA）和蛋白质组学数据（Wang et al., Cancer Cell, 2021）以及实验验证（免疫组织化学、蛋白质印迹）分析了EIPs在胶质母细胞瘤样本中的表达。核心机制研究采用了CRISPR-Cas9介导的基因敲除技术，构建了EIP单敲除和双敲除细胞系。为了绘制PP2A的相互作用网络，研究使用了基于BioID2的邻近标记蛋白质组学技术。功能验证方面，通过克隆形成实验评估放射敏感性，通过彗星实验和γH2AX免疫荧光检测DNA损伤修复能力，通过细胞周期分析和流式细胞术评估细胞命运。体内实验则使用免疫缺陷小鼠建立了颅内肿瘤模型，并结合了靶向放疗平台进行疗效评估。
研究结果
PP2A抑制蛋白的异常表达促进GBM肿瘤发生
研究人员发现，在胶质母细胞瘤组织和细胞系中，三种内源性PP2A抑制剂（SET、ANP32A和CIP2A）的mRNA和蛋白水平显著高于正常脑组织，而其他调控PP2A的酶类则表达较低。这提示EIPs的过表达是胶质母细胞瘤抑制PP2A的主要机制。通过CRISPR-Cas9敲除这些EIPs基因，可以恢复PP2A催化亚基的甲基化（PP2A-C活性标志），并显著抑制肿瘤生长。其中，敲除SET几乎完全阻断了小鼠体内肿瘤的形成，而敲除ANP32A和CIP2A也能显著延长荷瘤小鼠的生存期。这些结果表明，这三种EIPs协同作用，抑制PP2A活性，从而驱动肿瘤进展。
PP2A相互作用组的蛋白质组学分析揭示了由EIPs调控的致癌信号枢纽
为了阐明EIPs如何通过抑制PP2A来保护特定的致癌信号通路，研究人员利用BioID2-PP2A-Aα融合蛋白进行了邻近标记蛋白质组学分析。结果显示，敲除不同的EIP会导致PP2A与一组特定的激酶和转录因子结合增加。具体而言：SET的缺失增强了PP2A与Akt、GSK3α/β、PKA C和STAT1的结合，并降低了它们的磷酸化水平；ANP32A的缺失增加了PP2A与NFκB p65和LYRIC的相互作用，抑制了它们的活性；而CIP2A的敲除则导致PP2A更多地结合STAT1/3并降低其磷酸化，同时还降低了原癌蛋白c-Myc的水平。这些发现表明，不同的EIPs各自“保护”着一套独特的致癌信号节点免受PP2A的“关闭”，共同维持了肿瘤的生存和增殖网络。
EIPs促进放射抵抗并促进GBM中辐射诱导的ATR和/或ATM激活
蛋白质组学数据提示，EIPs的缺失会增加PP2A与DNA损伤应答（DNA Damage Response， DDR）关键激酶ATM和ATR的相互作用。功能实验证实，敲除任一EIP均使胶质母细胞瘤细胞对辐射更加敏感。机制上，EIPs的缺失削弱了辐射诱导的ATM和ATR激活。邻近连接实验进一步显示，在辐射后，SET的缺失主要增强了PP2A与ATM在细胞核内的相互作用，而ANP32A和CIP2A的缺失则促进了它们在细胞质中的结合。这表明EIPs通过阻止PP2A去磷酸化ATM/ATR，维持了肿瘤细胞高效的DNA损伤应答能力，从而导致放射抵抗。
EIPs维持辐射后的DNA损伤修复和G2/M检查点控制
ATM和ATR的激活对于启动DNA修复和执行细胞周期检查点至关重要。研究发现，EIP缺失的细胞在遭受辐射后，单链和双链DNA断裂的修复能力受损，DNA损伤标志物γH2AX的清除延迟。同时，这些细胞中由ATR/ATM下游的CHK1所介导的G2/M期检查点（细胞在DNA损伤后暂停分裂进行修复的关键机制）功能也出现障碍。具体表现为，SET和ANP32A敲除的细胞无法有效停留在G2/M期，而是过早地重新进入细胞周期，而CIP2A敲除的细胞则停滞在G2/M期并出现多核化等有丝分裂异常。这说明EIPs通过保护ATM/ATR-CHK1轴，确保了DNA损伤的有效修复和细胞周期的正确调控。
EIPs保护GBM免受辐射诱导的有丝分裂细胞死亡，并以不依赖p53的方式促进放射抵抗
研究人员进一步探究了EIP缺失细胞对辐射敏感后所经历的细胞死亡方式。他们发现，辐射主要诱导了SET和ANP32A敲除细胞发生有丝分裂灾难（一种与异常有丝分裂相关的细胞死亡），而非典型的细胞凋亡；而CIP2A敲除细胞则倾向于进入衰老状态。此外，研究还探讨了肿瘤抑制因子p53的作用。敲低p53本身能使正常细胞对辐射产生一定抵抗，但却进一步增强了EIP缺失细胞（尤其是SET敲除细胞）的放射敏感性。这表明，EIPs介导的放射抵抗机制与p53的状态存在复杂的交互关系，且不单纯依赖于p53通路。
抑制ATM或CHK1选择性地增强对照细胞的放射增敏作用，但对EIP敲除细胞无效
为了确认ATM/CHK1通路抑制在EIP缺失细胞放射增敏中的作用，研究人员使用了ATM抑制剂（KU-55933）和CHK1抑制剂（AZD7762）。结果显示，这些抑制剂能显著增加野生型（对照）细胞对辐射的敏感性，但对于已经缺失EIPs的细胞，这种增敏效果却大大减弱或消失。这一关键实验反向证明，EIPs正是通过阻止PP2A抑制ATM-CHK1轴，来赋予肿瘤细胞放射抵抗能力的。当EIPs缺失时，该轴已被PP2A抑制，因此外源药物抑制剂便失去了增效作用。
联合抑制EIPs可增强肿瘤抑制效果并提高GBM的放射敏感性
研究发现，EIPs之间存在调节反馈。例如，在SET或ANP32A敲除的细胞中，PP2A与CIP2A的相互作用会增加。这促使研究人员尝试联合靶向多个EIPs。他们成功构建了ANP32A和CIP2A的双敲除细胞系，发现这能产生叠加效应，更有效地恢复PP2A活性，并同时抑制更多致癌转录因子（如STAT1/3、c-Myc、NFκB和LYRIC）的活化。在动物实验中，与单敲除相比，双敲除能更显著地延长荷瘤小鼠的生存期，并进一步增强肿瘤对放疗的反应。这提示联合靶向EIPs可能是一种更有效的治疗策略。
研究结论与讨论
本研究系统阐明了胶质母细胞瘤通过过表达SET、ANP32A和CIP2A这三种内源性抑制剂，来抑制关键肿瘤抑制因子PP2A活性的新机制。这不仅维持了多种致癌激酶和转录因子（如Akt、STAT、NFκB、c-Myc等）的持续活化，驱动肿瘤生长，更重要的是，它还保护了DNA损伤应答的核心激酶ATM和ATR免受PP2A的负调控。因此，当肿瘤遭受放疗时，EIPs能确保高效的DNA修复和细胞周期检查点功能，从而导致放射抵抗。
这项研究的重大意义在于：首先，它揭示了胶质母细胞瘤信号通路可塑性和治疗抵抗的一个上游核心枢纽——PP2A抑制。靶向这些EIPs，有望同时“瓦解”多条下游致癌通路和DNA修复机制，克服肿瘤的适应性抵抗。其次，研究首次将SET和ANP32A与胶质母细胞瘤的放射抵抗直接联系起来，并阐明了其通过PP2A-ATM/ATR轴起作用的具体机制。第三，研究验证了联合靶向多个EIPs能产生协同抗肿瘤和放射增敏效果，为开发联合疗法提供了理论依据。最后，鉴于EIPs（如CIP2A）在胶质母细胞瘤中高表达而在正常组织中有限，靶向它们可能具有较好的治疗选择性，从而在增强放疗效果的同时，减少对正常脑组织的毒性。
当然，研究也存在一些局限，例如体内实验主要在免疫缺陷小鼠中进行，未能评估免疫系统的作用；某些EIP组合敲除（如SET+CIP2A）因细胞无法存活而难以研究。未来的研究需要在免疫活性模型和更多患者来源的模型中进行验证，并进一步探索EIPs调控的其他层面（如代谢和染色质相关蛋白）。尽管如此，这项工作无疑为开发针对胶质母细胞瘤这一“癌王”的新型疗法——尤其是能够逆转放疗抵抗的联合策略——点亮了新的方向。
