阐明Bacillus smithii中生物活性胞外多糖XY1-EPS的代谢网络及其pH依赖性生物合成机制

《Carbohydrate Polymers》：Elucidating the metabolic network and pH-dependent biosynthesis of bioactive exopolysaccharides XY1-EPS in Bacillus smithii

研究聚焦枯草芽孢杆菌XY1产生的胞外多糖XY1-EPS，揭示其生物合成机制及抗氧化、肠炎保护功能。体外实验显示其浓度依赖性抗氧化活性，体内实验表明可显著提高斑马鱼肠炎模型生存率。响应面法确定pH为关键影响因素，转录组学解析pH调控的代谢网络，首次构建该菌株完整代谢网络，鉴定gtrB等关键基因。HPLC分析表明XY1-EPS由葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸和N-乙酰葡糖胺组成，纯化产物XY1-EPS2具有显著生物活性。该研究为微生物胞外多糖的功能开发提供理论依据。

　　

Nan Zhao|Xinyue Fan|Muhammad Naveed Sheas|Ting Yu|Fujie Yan

浙江大学生物系统工程与食品科学学院食品科学与营养系，中国杭州310058

摘要

与需要较长农业生长时间和收获后提取过程的植物来源多糖相比，微生物外多糖得益于快速的微生物生长，从而缩短了整体生产周期，并提高了工艺可控性和批次间的一致性。本研究重点关注由Bacillus smithii XY1产生的外多糖（XY1-EPS），旨在阐明其生物合成机制和功能特性。XY1-EPS通过清除自由基表现出明显的浓度依赖性抗氧化活性，并在斑马鱼肠炎模型中显示出显著的保护作用，显著提高了存活率。利用响应面方法学分析，发现pH值是影响XY1-EPS产量的最关键因素。在不同pH条件下的比较转录组分析揭示了参与其生物合成的关键调控网络。此外，首次绘制了B. smithii XY1的完整代谢网络，详细说明了六种糖核苷酸前体的代谢途径，并确定了负责外多糖合成的基因簇。还鉴定了一种关键的糖基转移酶基因gtrB，该基因对XY1-EPS的组装和分泌至关重要。HPLC分析表明，XY1-EPS由葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸和N-乙酰葡糖胺组成。纯化的XY1-EPS2组分仅含有N-乙酰葡糖胺，显示出显著的有益潜力。本研究为微生物外多糖的定向生物合成和功能利用提供了基础见解。

引言

多糖在自然界中广泛分布，可根据其来源生物分为植物多糖、动物多糖和微生物多糖三类（Liang等人，2024年）。其中，微生物多糖因其结构多样性和功能多样性而受到越来越多的研究关注。它们通常被分为细胞内多糖（Cifuente等人，2024年）、细胞壁多糖（Larson & Yother，2017年）和细胞外多糖（Sen等人，2025年），每种类型在生物过程中扮演不同的角色（Wang, Mao等人，2024年；Wang, Zheng等人，2024年）。糖生物学领域的进展逐渐揭示了许多多糖的分子结构和反应机制（Chen等人，2024年）。目前，关于Bacillus来源多糖的研究涵盖了从结构分析和功能验证到应用探索的整个过程。迄今为止报道的这些多糖在结构类型、分子构象和生物活性方面表现出显著的多样性，包括抗氧化和免疫调节作用（Yang等人，2025年）。此外，这些多糖具有生产速度快和安全性高的优势（Zayed等人，2021年），且单一菌株能够产生多种类型的多糖（Malick等人，2017年）。它们的结构和功能多样性，加上良好的加工特性和生物活性，使得Bacillus来源的外多糖成为天然大分子中的有力候选者（Yang等人，2025年）。然而，多糖别构调控的机制、生物合成途径和关键遗传决定因素仍不明确。这一知识空白阻碍了功能性微生物多糖的定向操控和高效生产。 Bacillus smithii XY1是一种从葡萄酒发酵残渣、高温堆肥或咖啡渣等环境中分离出的耐热Bacillus菌株（Huang等人，2021年；Tian等人，2018年），在制药、化工和食品领域具有广泛的应用潜力（Ji等人，2023年；J?ogi等人，2007年）。该菌株对胃酸和高温具有显著的耐受性（Zhao等人，2023年），使其作为益生菌比传统商业菌株更具优势，并能在食品加工过程中表现出优异的性能（Zhao等人，2024年）。先前的研究表明，B. smithii XY1通过激活抗氧化途径可以缓解斑马鱼中的硫酸葡聚糖诱导的肠道炎症（Huang等人，2021年）。

尽管这些有益效果很有前景，但该菌株产生的外多糖尚未得到研究。我们假设B. smithii XY1合成的外多糖具有独特的结构和生物活性特性，这些特性有助于其应激适应功能并产生有益效果，并且其生物合成过程在环境条件下受到转录水平的调控。迫切需要系统研究B. smithii XY1外多糖的结构和功能及其在应激条件下的转录调控机制。确定关键合成基因将加深我们对微生物应激拮抗机制的理解，并为开发新型细菌多糖产品提供支持。

细菌菌株和培养

B. smithii XY1是一种革兰氏阳性兼性厌氧菌，由我们实验室从咖啡渣中分离得到（Huang等人，2021年）。在后续实验中使用前，进行了二次活化培养以保持菌株的活力。使用灭菌接种环从保存的菌株中取样，并在Trypticase Soy Broth（TSB）琼脂上培养（17.0?g/L色氨酸（Biosharp），3.0?g/L大豆胨（Biosharp），5.0?g/L氯化钠（99.5%，Macklin），2.5?g/L磷酸二钾（99%，aladdin）。

XY1-EPS的体外和体内生物活性评估

B. smithii XY1表现出明显的黏液表型，表明其能分泌外多糖（图1A）。先前的研究已证实其出色的益生菌特性，符合益生菌候选菌株的筛选标准（Gao等人，2024年；Huang等人，2021年；Ji等人，2023年）。鉴于黏液表型通常与外多糖的产生相关，我们推测该菌株的功能益处可能与其生物活性密切相关。

结论

总之，本研究系统阐明了B. smithii XY1产生的外多糖的生物合成调控和功能特性。多变量响应面优化分析确定pH值是影响外多糖产量的最关键因素。通过转录组整合，首次绘制了该菌株中核苷酸前体的完整代谢网络，证实其具备合成六种核苷酸的完整途径。

CRediT作者贡献声明 Nan Zhao：撰写——初稿、可视化、验证、方法学、研究、正式分析、数据整理。 Xinyue Fan：研究。 Muhammad Naveed Sheas：研究。 Ting Yu：撰写——审阅与编辑。 Fujie Yan：撰写——审阅与编辑、监督、项目管理、方法学、概念构思。

未引用参考文献

Gao等人，2023年

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系。

致谢

我们感谢浙江大学医学院斑马鱼核心设施的Yingniang Li提供的技术支持。