尿液游离皮质醇检测：通过LC-MS/MS技术提升其在库欣综合征管理中的临床应用效果

《Clinica Chimica Acta》：Urinary free cortisol analyses: Enhancing their clinical performance in Cushing's syndrome management by means of LC-MS/MS

本研究开发了一种基于直接进样的LC-MS/MS方法，用于同步测定24小时游离皮质醇、皮质酮和地塞米松，以替代免疫分析并提高临床诊断准确性，同时评估皮质酮与皮质醇/皮质酮比值作为辅助生物标志物的临床意义。

　　

安娜·鲁比奥（Ana Rubio）|圣地亚哥·托费（Santiago Tofé）|安东尼亚·巴塞洛（Antonia Barceló）

西班牙帕尔马市索恩埃斯帕塞斯大学医院（Hospital Universitario Son Espases）实验室医学部，地址：Valldemossa路79号，邮编07010

摘要

24小时尿游离皮质醇（UFC）分析是库欣综合征（Cushing's Syndrome, CS）诊断确认过程中推荐的三种初步检测方法之一。然而，由于使用了免疫测定法（immunoassays, IAs）或同时使用了外源性糖皮质激素等原因，该方法有时会导致结果不准确。

本研究旨在开发一种快速且准确的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法，以最终替代免疫测定法，并通过同时监测UFC、皮质醇和地塞米松来提供相关的临床信息。

我们开发了一种基于直接注射方法的LC-MS/MS技术，并对其进行了全面表征，用于目标分析物的定量。我们建立了基于人群的参考范围，并全面评估了皮质醇以及皮质醇/皮质醇比率在库欣综合征患者随访或临床怀疑高皮质醇血症中的潜在辅助作用。同时，还检测了地塞米松的存在情况，以排除无效样本。

对照组与高/低皮质醇血症患者之间的皮质醇和皮质醇/皮质醇比率存在显著差异；当结合使用这两种生物标志物时，LC-MS/MS测得的数值具有较高的生化一致性。在研究对象中，有高达7.7%的样本检测到了地塞米松。

所提出的LC-MS/MS方法不仅能够停止使用免疫测定法，还提供了对库欣综合征管理具有重要意义的额外生物标志物，从而提高了UFC分析的总体临床效果。

引言

库欣综合征（CS）的特点是高皮质醇血症，这可以通过临床实验室检测方法（如24小时尿游离皮质醇（UFC）来检测和监测。UFC检测是推荐的三种初步检测方法之一，另外两种方法是夜间1毫克地塞米松抑制试验和深夜唾液皮质醇检测 [1]、[2]。

UFC水平通常变化较大，因此至少需要收集两次24小时尿样来进行库欣综合征的筛查/监测 [1]、[2]。此外，由于结果异常或生化不一致，往往还需要进一步检测24小时尿样。这不仅增加了患者的负担，还可能导致库欣综合征的诊断和管理延迟。

这些不一致的结果可能源于未申报的外源性糖皮质激素使用或分析方法本身的局限性，尤其是当使用免疫测定法（IA）进行UFC检测时，因为其特异性较低。

因此，有必要改进UFC检测的方法，并加入能够辅助临床解释的补充生物标志物，尤其是在遇到意外或不一致的结果时。

此外，还应考虑在UFC检测中同时监测外源性糖皮质激素，但这在临床实践中并不常见。

液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）被认为是UFC定量最合适的替代方法 [3]、[4]、[5]、[6]、[7]，因为它克服了免疫测定法的局限性，并且可以同时检测多种分析物。

在库欣综合征的管理中，之前已有研究建议同时使用LC-MS/MS检测UFC和皮质醇，以及利用皮质醇/皮质醇比率 [8]、[9]、[10]、[11]、[12]、[13]、[14]、[15]、[16]、[17]、[18]、[19]。在我们的研究中心（西班牙帕尔马市索恩埃斯帕塞斯大学医院），对于地塞米松的检测尤为重要，因为UFC检测后通常会进行夜间1毫克地塞米松抑制试验，而患者在尿液收集前或过程中可能会误服地塞米松。

尽管LC-MS/MS方法具有优势，但其样品制备过程通常较为耗时（例如需要液-液萃取 [20]），因此在大多数临床实验室中仍无法完全避免使用免疫测定法。据我们所知，在西班牙的公共医疗系统中，所有医院仍使用免疫测定法进行UFC检测。质谱技术仅在三级医疗机构或学术医院中使用，且通常与免疫测定法结合使用以处理大量样本。在这种情况下，LC-MS/MS检测中加入补充生物标志物尤为重要，因为不同方法之间可能会出现结果不一致的情况。

基于以上原因，本研究开发了一种基于直接注射方法的新型、快速且准确的LC-MS/MS技术，用于UFC、皮质醇和地塞米松的定量。由于参考范围缺乏标准化，因此建立了基于人群的LC-MS/MS参考值。

大多数研究仅关注皮质醇和皮质醇/皮质醇比率在区分异位ACTH生成与其他类型的库欣综合征方面的作用 [3]、[4]、[5]、[6]、[7]、[8]、[9]、[10]、[11]、[12]、[13]、[14]、[15]、[16]、[17]、[18]、[19]。因此，本研究评估了这些生物标志物作为补充指标的适用性，以及它们对UFC检测临床解释的辅助作用。

据我们所知，这些生物标志物在低皮质醇血症的监测中的应用尚未得到充分研究。这在库欣综合征的随访中尤为重要，因为肾上腺切除术/垂体手术或药物治疗（如酮康唑、美曲唑）可能导致肾上腺功能不全。因此，本研究也考虑了这一情况。

材料与方法

本研究已获得巴利阿里群岛当地研究伦理委员会的批准（2024年6月；批准编号IB 5525/24 PI）。

LC-MS/MS方法验证

与其它测试添加剂相比，使用0.5 mM的NH₄F显著提高了皮质醇和皮质醇的信噪比（S/N），平均提升幅度分别为250%和350%，以及200%和300%，从而实现了最低的检测限（LOQ）（见表2）。因此，选择0.5 mM的NH₄F作为本研究方法的添加剂。增加添加剂浓度并未进一步提高信噪比。

对10个不同尿样的分析未发现干扰信号。

讨论

在之前发表的研究中 [20]，已经证明了LC-MS/MS在UFC检测方面的优越性。本研究开发了一种基于直接注射方法的新型高效LC-MS/MS技术，用于UFC、皮质醇和地塞米松的定量，并对其进行了全面表征。

该方法每批样本的检测时间预计可缩短2小时，相比更复杂的检测方案，工作量可减少多达92%。

作者贡献声明

安娜·鲁比奥（Ana Rubio）：负责撰写初稿、方法验证、软件开发、实验设计、数据分析及数据整理。

圣地亚哥·托费（Santiago Tofé）：负责撰写、审稿与编辑、项目管理和实验指导。

安东尼亚·巴塞洛（Antonia Barceló）：负责撰写、审稿与编辑、项目管理和实验指导。

资金支持

本研究未获得任何公共部门、商业机构或非营利组织的资助。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益冲突或个人关系。

致谢

作者感谢索恩埃斯帕塞斯大学医院（西班牙帕尔马市）对本研究的支持。