《PLOS Biology》：Transcriptomic and chromatin accessibility profiling unveils new regulators of heat hormesis in Caenorhabditis elegans
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本文通过结合RNA-seq和ATAC-seq的多组学策略，纵向解析了秀丽隐杆线虫在热激预处理（热激效应）过程中的动态分子响应。研究发现，温和热暴露引发的转录组和染色质可及性变化在恢复期大多可逆，但为后续剧烈热休克（HS）挑战留下了独特的分子“印记”，这构成了增强热耐受性和寿命延长的生理基础。研究不仅揭示了剂量依赖的分子响应，还鉴定出多个在热激效应中起关键作用的高度保守调控因子，如HSF-1、FOS-1、MARS-1、SNPC-4、ELT-2和DPY-27，并指出热激效应对寿命的延长依赖于生殖系的短暂扰动。该研究为理解应激适应、健康衰老的分子机制及“中年应激管理”策略提供了重要的分子框架。
文章内容总结
引言
短暂暴露于轻度应激（一种称为“激效应”的现象）能够激活适应性机制，带来长期的保护效应并促进健康。其中，“热激效应”特指由轻度热应激触发的有益结果，这种现象在从酵母到人类等多种物种中均有记载，例如桑拿疗法。然而，尽管在多种物种中观察到了热激效应的益处，其分子机制仍未完全阐明。秀丽隐杆线虫因其遗传可操作性、明确的应激反应和较短的寿命，成为解析热激效应机制的理想模型。本研究旨在通过纵向多组学分析，填补在追踪整个热激效应方案（包括随后的应激挑战）中跨时间变化的知识空白，以揭示与改善生理结果相关的关键分子见解，并识别保护效应的可能调控因子。
结果
1. 预处理诱导热耐受性
为了理解热激效应的分子基础，研究团队在秀丽隐杆线虫成年早期对其进行了为期6小时、30°C的暴露（称为“预处理”），然后在20°C恢复，最后用35°C或37°C进行热休克（HS）挑战。结果发现，预处理显著提高了野生型（WT）和生殖系缺失突变体glp-1(ts)线虫的热耐受性（基于运动能力评分），且这种增强的热耐受性在20°C恢复12或48小时后依然存在，但在96小时恢复后效果减弱。这表明两种线虫都能长时间“记住”预处理经历，从而对后续的HS挑战表现出更强的抵抗力。不同预处理时长的测试表明，6小时预处理比更短的预处理时间能诱导更强的保护效应。此外，在HS后，经过预处理的线虫比未经处理的对照存活时间更长。
2. 热激效应中的转录组和染色质可及性分析
为了研究短暂的轻度热应激暴露（即预处理）如何赋予后续更强烈HS抵抗力的分子基础，研究团队在热激效应方案的关键时间点，分别使用RNA-seq和ATAC-seq分析了mRNA表达和染色质可及性。多组学分析首先在缺乏生殖系细胞的glp-1(ts)突变体中进行，以评估体细胞的分子变化，并最大限度地减少生殖期线虫早期成年期广泛基因表达动态可能带来的混杂效应。
在未经预处理的对照组中，在正常培养温度下，时间点1和2仅检测到微小的变化，可能反映了正常的发育进程。然而，HS在RNA表达和染色质可及性方面均诱导了剧烈变化，这些变化与之前报道的热应激诱导的基因表达谱有显著重叠，支持了本研究结果的可靠性。
3. 预处理诱导的变化在恢复后基本复原
在预处理组中，RNA-seq和ATAC-seq均显示预处理后立即发生了大量变化。然而，在20°C恢复12小时后，这些预处理响应性变化中的绝大多数发生了逆转，表明预处理诱导的转录和染色质可及性程序是短暂且可逆的。在35°C进行HS时，预处理组在RNA表达和染色质可及性方面也观察到了剧烈的变化，与对照组相似。将HS时间点直接与基线比较，也支持预处理诱导的大多数变化是瞬时的，并在时间点2恢复至基线水平的结论。
4. 不同水平的热应激诱导基本不同的RNA或染色质可及性变化
为了进一步表征整个激效应方案中RNA表达和染色质可及性的动态变化，研究团队对RNA-seq或ATAC-seq中与显著变化相关的基因进行了K均值聚类分析。尽管RNA-seq和ATAC-seq揭示了在整个激效应方案中与显著变化相关的不同基因集，但聚类分析显示出相似的变化模式。这些共享模式可分为三类：预处理响应性变化、HS响应性变化以及预处理+HS响应性变化。预处理响应性变化描述了那些在预处理后上调或下调，并在恢复后呈现相反趋势的变化。HS响应性变化则在HS时显示出RNA表达或染色质可及性的剧烈变化，而在预处理和恢复后观察到的变化最小。最后一类包括对预处理和HS都有响应的基因，其中大多数在预处理和HS时表现出一致的上调或下调。基因本体（GO）分析揭示了各类变化中潜在具有生物学相关性的功能类别。
5. 经过预处理的线虫在HS时表现出与未处理线虫不同的RNA表达和染色质可及性
为了揭示预处理线虫保护效应的分子基础，研究评估了预处理组和对照组在各个时间点的RNA表达和染色质可及性差异。在时间点1，预处理组和对照组之间的变化与P1与NC之间的比较结果基本相似。在时间点2，仅检测到少量显著差异，这与预处理诱导的大多数变化在恢复后复原的结论一致。然而，尽管在恢复后观察到最小差异，但在HS 3或6小时后，两组之间检测到了RNA表达和染色质可及性的显著差异，这表明早期的热预处理留下了潜在的分子“记忆”。与表型观察一致，6小时HS后检测到的差异远多于3小时HS后。在预处理组中表达显著上调或染色质更开放的基因中，脂质代谢和胶原蛋白是显著富集的GO术语；而在表达显著下调的基因中，解毒应激反应、病原体应激反应和脂质代谢是显著富集的GO术语。
6. WT表现出与生殖系缺失突变体相似的热激效应转录组和染色质可及性动态
为了验证研究发现的普适性，研究团队在WT N2品系中进行了并行的多组学分析。WT线虫在整个热激效应方案中表现出与glp-1(ts)突变体高度一致的转录组和染色质可及性动态。在WT中，再次观察到预处理响应性变化在恢复后基本复原，并且不同水平的热应激诱导了基本不同的转录组和染色质可及性谱。这些结果表明WT和glp-1(ts)共享相似的多组学响应，支持热激效应背后的一些分子变化具有广泛的通用性。有趣的是，总体上在WT中检测到的差异表达基因较少，这可能是由于生殖系的动态变化掩盖了体细胞对热激效应的响应。
7. 多组学数据揭示了热激效应诱导的热耐受性的新调控因子
为了评估预处理和未处理线虫之间的差异分子变化是否有助于轻度热应激预处理诱导的保护效应，研究采用了两种策略选择候选基因，并使用RNAi测试了它们在与热耐受性相关的功能。第一种策略优先考虑在HS 6小时后，RNA表达和染色质可及性在预处理组与对照组相比均上调的基因。在测试的五个候选基因（mars-1, endu-2, bath-44, vha-9, cut-5）中，只有mars-1的敲低显著损害了预处理线虫的生存优势。第二种策略侧重于预测调控所观察到的分子变化的转录因子，目的是识别在热激效应中起作用的调控因子。基序分析揭示了显著富集的基序分为三组：基于ATAC-seq和RNA-seq结果均富集的基序；仅基于RNA-seq结果富集的基序；仅基于ATAC-seq结果富集的基序。从富集基序列表中，研究选择了候选因子进行进一步功能测试。RNAi敲低证实hsf-1对glp-1(ts)中的热激效应至关重要，因为它完全消除了预处理线虫对HS的增强生存能力。敲低snpc-4也显著损害了glp-1(ts)中预处理诱导的生存优势。在基于差异RNA-seq数据揭示的基序中，GATA转录因子ELT-2和ELT-6以及锌指转录因子PQM-1的基序在预处理和HS后下调的基因中富集。RNAi敲低elt-2完全消除了预处理glp-1(ts)线虫的HS生存优势。在基于差异ATAC-seq数据揭示的基序中，DPY-27（剂量补偿复合物DCC的凝缩蛋白样亚基）的基序在预处理和HS后下调的峰区域中富集。FOS-1（c-Fos同源物，AP-1组分）和ATF-7（bZIP转录因子）的基序在HS后上调的峰区域中富集。RNAi敲低fos-1 consistently损害了预处理glp-1(ts)的热生存优势。这些发现将HSF-1、SNPC-4、ELT-2和FOS-1确定为glp-1(ts)中热激效应方案诱导的热耐受性表型的推定介质。研究进一步测试了在glp-1(ts)中发现的新的热激效应调控因子在WT中是否也起类似作用。有趣的是，敲低hsf-1、snpc-4、fos-1和mars-1损害了WT背景中预处理线虫的热耐受性益处，表明这些调控因子对于介导热激效应的有益效应具有广泛的重要性。然而，elt-2的RNAi敲低并未损害WT中预处理诱导的热耐受性，而在glp-1(ts)中则相反。同样，尽管dpy-27 RNAi在glp-1(ts)突变体中显示出可变效应，但其敲低 consistently减弱了WT中预处理诱导的热耐受性。这些结果突显了几个在WT和glp-1(ts)中都具有主要效应的推定热激效应调控因子，同时也指出了在特定遗传背景中起作用的因子。
8. 短暂的生殖系缺陷和保留的HSP诱导性可能是热激效应诱导寿命延长的基础
热激效应因其延长寿命的益处而被广泛认识。本研究证实，在WT中，预处理方案能延长寿命；然而，有趣的是，相同的方案并未进一步延长长寿的glp-1(ts)突变体的寿命。为研究这种差异，研究首先检查了生殖功能。预处理导致WT的总后代数量小幅但显著减少，这是由于在预处理期间产下的胚胎数量减少（且在此期间产下的胚胎也无法存活），以及在预处理后12小时内存在残留缺陷，此后产卵和胚胎活力恢复正常。对WormExp比较结果的重新检查表明，对于预处理诱导的上调基因，与生殖系干细胞去除相关的基因和glp-1(ts)上调基因属于最显著富集的类别，这证实了在热预处理期间生殖系增殖被暂时停止。先前研究表明，WT线虫在成年早期表现出减弱的HS反应，证据是HS后hsp基因（包括hsp-16和hsp-70）的诱导显著降低。为了测试热预处理是否影响这一调控步骤，研究使用HS后第1天或第3天成年线虫的RNA-seq数据，检查了预处理和未处理WT及glp-1(ts)线虫在成年早期hsp基因的诱导性。数据证实WT在第3天hsp诱导减少，而glp-1(ts)未显示这种成年早期的下降。引人注目的是，研究发现预处理逆转了WT中hsp基因诱导的下降，经过预处理的第3天成年线虫保持的hsp诱导水平与第1天成年线虫相当。这些结果表明，热预处理在WT的生殖期保留了HS反应的诱导性。
讨论
本研究全面展示了WT和生殖系缺失的glp-1(ts)突变动物在热激效应方案中的转录组和染色质可及性动态，揭示了剂量依赖效应的分子证据，其中不同水平的热应激引发不同的分子响应。尽管预处理诱导的RNA表达和染色质可及性变化在恢复期后基本复原，但早期的应激暴露留下了具有持久生理后果的独特分子印记。值得注意的是，对WT和glp-1(ts)动物的比较分析表明，热预处理期间的生殖系响应深刻影响长期生理，导致平均和中位寿命显著延长。重要的是，本研究鉴定了几种高度保守的热激效应调控因子，其中一些在两种遗传背景中广泛作用，而另一些则以环境依赖的方式发挥作用。这些发现提供了一个连接短暂应激暴露和长期生理益处的分子框架，对于理解如何通过中年应激管理促进健康衰老具有重要意义。
分子剂量依赖效应的证据
结合RNA-seq和ATAC-seq的策略在揭示热激效应过程中的分子变化方面被证明是互补的。在RNA表达和染色质可及性发生变化的单个基因水平，以及在各种基因集中富集的生物学功能水平，数据都提供了令人信服的证据，表明不同水平的热应激诱导差异化的分子响应。这与激效应的基本概念相符，即应激源产生剂量依赖效应。
RNA-seq和ATAC-seq之间的适度相关性
研究观察到RNA-seq和ATAC-seq数据集之间的相关性适度，这与之前ATAC-seq和RNA-seq结果通常不相关的发现一致，反映了可能不相关的基因调控不同模式。未来针对上述局限性的后续分析，包括单细胞转录组学和能够区分对转录后调控的即时转录响应的基因组策略，可能会更深入地理解热激效应过程中的基因调控格局。
热激效应的新调控因子
结合功能筛选的多组学数据，为识别热预处理诱导的热耐受性的候选调控因子提供了关键切入点。HSF-1是启动HS反应的主要转录因子，从分析中显现出来，证明调查策略在发现热应激反应的真正调控因子方面是有效的。ELT-2是GATA转录因子，对秀丽隐杆线虫的肠道发育和免疫至关重要。先前工作表明，ELT-2是HSF-1缺陷线虫中增强热耐受性所必需的，这表明ELT-2和HSF-1可能作用于互补通路。研究发现ELT-2对glp-1(ts)突变体中的热预处理诱导的热耐受性至关重要，但在WT中非必需，突出了生殖系和肠道之间可能的组织间相互作用，并将ELT-2定位为激效应的环境依赖性调控因子。DPY-27是人类SMC4的同源物，是DCC的凝缩蛋白样亚基，在介导预处理WT的热耐受性中起持续作用，但在glp-1(ts)中则不然。FOS-1是c-Fos的同源物，是激活蛋白-1（AP-1）复合物的一个亚基，对WT和glp-1(ts)中介导热预处理诱导的热耐受性至关重要。年龄依赖的AP-1在染色质上的重新分布被推测反映了一种“表观遗传记忆”，这可能与本研究的发现一致，即FOS-1 DNA基序在预处理线虫中更开放的染色质区域特异性富集，表明其在热激效应中通过染色质开放维持应激记忆的作用。SNPC-4是小核RNA激活复合物（SNAPc）的一个亚基，对秀丽隐杆线虫中piRNA的转录至关重要。有趣的是，先前研究表明高温抑制piRNA的生物合成。此外，与piRNA在热激效应中可能的作用一致，编码结合piRNA的Piwi家族Argonaute蛋白的prg-1，是少数在热激效应过程中表现出持续上调的基因之一。这些发现暗示转录后调控参与热激效应。MARS-1是一种保守的甲硫氨酰tRNA合成酶。mars-1敲低增强了未处理线虫的热耐受性，而热预处理仅带来边际的额外保护。有趣的是，人类MARS1突变与整合应激反应的慢性激活有关，这表明从线虫到人类，其在应激反应中具有保守作用。从本研究中鉴定出MARS-1暗示了蛋白质合成过程中甲硫氨酸掺入与预处理诱导的保护效应之间的可能联系。总之，本文鉴定的热激效应推定新调控因子指向了基因表达调控的不同步骤在介导热激效应有益效应中的作用。这些调控因子高度保守，对其进一步表征有望揭示可广泛适用于应激适应和健康寿命调控的机制原理。
生殖系依赖的热激效应机制
在WT和glp-1(ts)中的互补研究得出了有趣的发现，即热激效应可能通过生殖系依赖机制延长寿命。多条证据支持这一结论。值得注意的是，虽然生殖系干细胞消融或其遗传模拟（如glp-1(ts)突变）被广泛认为可延长秀丽隐杆线虫的寿命，但本研究证明，对热应激的暂时性、短暂的生殖系活动干扰会对生理效应产生持久而显著的影响。此外，数据显示特定的热激效应调控因子，如HSF-1、ELT-2和DPY-27，以遗传背景依赖的方式调节应激适应。这些结果具有更广泛的意义：虽然激效应应激可以增强应激适应性和寿命，但其益处可能与生殖或发育功能的权衡交织在一起。未来的研究需要在分子水平上进一步研究这些复杂的关系，特别是空间分辨率，这对于开发在不损害短期生活质量的前提下促进健康衰老的应激管理策略至关重要。此外，观察到热激效应方案主要延长平均和中位寿命，而非最大寿命，并诱导生存曲线轻微“方形化”，表明早、中期死亡率显著降低。重要的是，这种模式类似于在发育过程中经历更高氧化状态的线虫的发现，这表明降低早、中期死亡率并提高平均和中位寿命（可能反映了健康寿命的改善）可能是应激激效应的普遍特征，与特定的应激源无关。阐明不同应激源如何产生共同且独特的应激反应和适应，将是未来研究的关键领域，这将为通过应激暴露和管理促进健康的干预措施提供信息。
