驱动双层角膜上皮层化的细胞间作用力：基于Voronoi细胞模拟模型的洞见

《PLOS Computational Biology》：Intercellular forces driving stratification in a two-layer corneal epithelium: Insight from a Voronoi cell-based simulation model

本文提出了一种基于Voronoi细胞的双层角膜上皮计算模型，通过整合细胞?基底黏附力、水平与垂直细胞间作用力，揭示了细胞分层（delamination）与TAC增殖之间的强关联，发现削弱细胞?基底相互作用的机制可无需外源生长因子诱导即可增强上皮更新，并阐明了表层细胞脱落率与克隆生长向心速度的直接联系，为理解角膜上皮稳态维持与损伤修复的力学调控提供了新视角。

　　

1 引言

角膜因其解剖结构简单、光学透明且易于成像，一直是生物学与理论研究者关注的重点。角膜最外层为角膜上皮，由5-7层细胞构成，其稳态依赖于两个协调过程：由角膜缘上皮干细胞（LESCs）产生的间质放大细胞（TACs）的向心迁移，以及层间细胞的垂直运动（分层）。尽管更新过程高度有序，但上皮层化的调控机制尚不明确。

2 角膜结构

角膜分为五层：上皮、Bowman层、基质、Descemet膜和内皮。角膜上皮为复层上皮，由内向外依次为基底细胞、翼细胞和表层细胞。角膜缘是角膜与巩膜交界处的环形区域，是LESCs的所在位置。LESCs通过不对称分裂产生一个LESC和一个TAC，TACs在基底内对称分裂并最终分化。细胞更新的“XYZ假说”提出：X（基底细胞增殖与向前迁移）、Y（细胞向角膜中心的向心运动）与Z（表层细胞脱落）三者之和保持平衡（X?+?Y?=?Z）。

3 模型描述

本研究构建了一个基于Voronoi细胞的二维模型（VCBM），模拟基底层与上层（suprabasal layer）两个独立层。模型包含三个核心过程：细胞运动、细胞分裂与细胞分层。

3.1 细胞运动

细胞运动基于牛顿第二定律与胡克定律，将细胞间连接视为弹簧，位移向量由弹簧合力与黏滞阻尼力决定，在强阻尼假设下，位移公式简化为：

Δr_i?=?λ?Δt?∑_j?(d_i,j???s)??_i,j，其中λ为运动参数，s为弹簧原长。

3.2 细胞分裂

LESCs以不对称分裂产生一个LESC（留在角膜缘）和一个TAC（向角膜内随机迁移0.05?μm）。TACs可进行最多n_max次对称分裂（实验估计为2–4次），之后成为终末分化细胞（TDC）并停止分裂。细胞分裂受局部种群密度调控：当细胞所受邻域力（F^neigh_i?=?k_n?∑_j?(d_i,j???s)）低于阈值F_th且已完成最小细胞周期时间（LESC约48小时，TAC约24小时）时，细胞才会分裂。

3.3 细胞分层

分层由三种力的平衡决定：细胞?基底黏附力（F^adh_i?=?k_a?A_i，与细胞表面积成正比）、水平力（同层细胞间的弹簧合力）与垂直力（上层细胞对基底细胞的向下作用力）。分层条件为：

F^adh_i?F^hor_i?+?F^ver_i。

3.4 参数估计

关键参数取值基于小鼠角膜实验数据：角膜半径约500?μm（实际小鼠为1500?μm，为计算效率缩小），TAC平均直径约15?μm，层间距h?=?15?μm，运动参数λ?=?0.01，时间步长Δt?=?0.1?小时。脱落率（r_s）依据兔角膜数据推算为0.0005?小时^?1。力常数（k_a、k_h、k_v）经敏感性分析在基准值±50%内调整。

3.5 敏感性分析

采用拉丁超立方抽样生成300组参数样本，计算Spearman等级相关系数（SRCC），评估各参数对向心生长、细胞分裂率、细胞大小及分层率的影响。

3.6 初始条件

模型将角膜简化为平面圆盘，基底层LESCs均匀分布在圆周，第二层在对应位置设置固定“幻影细胞”以界定边界。系统从空状态模拟约5000小时（≈208天）至稳态，以此为后续模拟的初始条件。

4 结果

4.1 基底层与第二层的向心生长

模拟显示，基底层与第二层均保持辐条状克隆生长模式，与小鼠角膜荧光显微图像一致。线性位移（LD）分析表明，基底层克隆凝聚力随n_max增加而下降，但第二层的向心模式几乎不受n_max影响，提示上层组织结构独立于基底层细胞分裂次数。

4.2 细胞分裂率与分层率对n_max的依赖关系

随n_max增大，TAC与LESC分裂率均下降，且TAC分裂率始终高于LESC，印证了LESCs的慢周期特性。分层率亦随n_max增加而降低，说明较高的TAC分裂能力可减少对分层补充的需求。

4.3 分层率与脱落率对细胞分裂率的影响

降低细胞?基底黏附力常数k_a可提高分层率，进而显著提升TAC分裂率（LESC分裂率变化较小），表明削弱细胞?基底相互作用可不依赖生长因子信号即加速上皮更新。增加第二层脱落率r_s会减少上层细胞数量，降低对基底细胞的向下压力，从而促进分层与基底细胞分裂；但当r_s过高（>0.002?小时^?1）时，分层率增速放缓，第二层细胞通过拉伸扩大面积以补偿细胞流失，这为角膜上皮表层出现大细胞的现象提供了力学解释。

4.4 克隆生长的向心速度

克隆尖端向中心移动的速度与脱落率r_s呈正相关。在基准脱落率（0.0005?小时^?1）下，模拟速度为0.05?μm/小时，低于实验报道的0.45?μm/小时；但当r_s提高至0.002?小时^?1时，速度可达0.31?μm/小时，与实验值接近。预测在多层模型中，上层细胞尺寸增大会进一步加速向心运动。

4.5 敏感性分析总结

• •
  运动参数λ：增大破坏两层向心模式。
• •
  TAC最大分裂次数n_max：增大降低基底层克隆凝聚力、TAC与LESC分裂率及分层率。
• •
  黏附力常数k_a：增大增强克隆凝聚力，降低分层率与TAC分裂率。
• •
  水平力常数k_h与垂直力常数k_v：k_h增大促进TAC分裂，k_v增大抑制TAC分裂。
• •
  弹簧原长s：增大减少基底层细胞数（细胞变大），降低分层率。
• •
  脱落率r_s：增大导致第二层细胞面积扩张，对基底层细胞尺寸影响较小。

5 讨论

本研究通过双层Voronoi细胞模型首次在力学框架下整合了角膜上皮的向心迁移与垂直分层过程。模型揭示了几个关键机制：

1. 1.
   上层组织独立性：第二层的向心生长模式对基底层TAC分裂次数n_max不敏感，这可能源于基底层特有的细胞?基底黏附与分裂活动。
2. 2.
   TAC对LESC的缓冲作用：TAC的高分裂能力可缓冲环境变化（如分层增加）对LESC的影响，维持其低分裂速率，这解释了LESCs的慢周期特性。
3. 3.
   力学调控的上皮更新：减弱细胞?基底黏附可直接提升分层与细胞更新速率，无需外源生长因子，这与紫外线损伤后基底膜降解伴随上皮更新加速的现象一致。
4. 4.
   脱落率与修复速度的关联：增加表层细胞脱落可加速基底细胞向心运动，类似伤口愈合时的快速迁移反应。
5. 5.
   细胞尺寸的力学补偿：过高脱落率下，上层细胞通过拉伸扩大面积以维持上皮完整性，这为表层大细胞的出现提供了一种力学解释。

局限与展望

模型参数部分基于现象学校准，单细胞水平的力学测量仍具挑战。当前模型仅包含两层，未来需扩展至多层（5-7层），并引入层间黏附力以更真实模拟分层。此外，模型基于小鼠角膜参数，人角膜因面积更大、LESC更多，模拟计算成本更高。该框架为研究角膜上皮稳态、伤口愈合及病理状态（如角膜缘缺陷）提供了可扩展的力学计算平台。