《Comparative Immunology Reports》：Bile acids supplementation promotes the growth of
Procambarus clarkii and improves its ability to resist pathogens infection
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本研究针对水产养殖中饲料转化效率低、应激频繁和疾病高发等关键挑战，探究了饲料添加剂胆汁酸(BAs)在克氏原螯虾(Procambarus clarkii)中的应用效果。研究发现，BAs补充能显著提升虾的体重、肝胰腺指数和甘油三酯(TG)水平，促进脂质合成、吸收和β-氧化相关基因表达。同时，BAs增强了肠道抗氧化应激能力，并通过调节抗脂多糖因子1(ALF1)和酚氧化酶原(proPO)的表达，显著提升了虾对白斑综合征病毒(WSSV)和副溶血弧菌(Vp)的抵抗力。此外，BAs重塑了肠道菌群结构，增加了促进糖脂代谢的菌群丰度，降低了破坏菌群稳态的菌群比例。结果表明，BAs是一种有潜力提升甲壳动物生长性能和抗病力的饲料添加剂。
在集约化水产养殖蓬勃发展的当下，克氏原螯虾（俗称小龙虾）已成为全球极具经济价值的重要淡水养殖品种，尤其在中国的产业规模已达数十亿美元。然而，低饲料转化率、频繁的应激反应以及高发的疾病，尤其是白斑综合征病毒(WSSV)和副溶血弧菌(Vp)这两种对甲壳动物危害最大的病原感染，已成为制约其高密度养殖发展的主要瓶颈。动物肠道不仅是营养吸收的核心场所，也是抵御外界应激和病原入侵的第一道防线。因此，寻找能够有效促进生长、增强抗病力并维持肠道健康的饲料添加剂，是实现水产养殖业可持续发展的一项关键策略。
胆汁酸(Bile acids, BAs)在脊椎动物肝脏中合成，在肠道中发挥其主要的生理功能，例如乳化膳食脂肪、促进脂溶性营养物质的吸收。不仅如此，BAs作为关键的代谢调节器和信号分子，还能影响脂质与葡萄糖代谢、调节先天免疫反应和炎症稳态，其两亲性结构还赋予其直接的抗菌特性，能够塑造肠道菌群组成。有趣的是，无脊椎动物自身不能合成BAs，必须从食物中获取。尽管已有研究表明BAs对多种水产动物有益，但其在克氏原螯虾等甲壳动物中的具体功能和内在机制尚不明确。因此，山东农业大学的研究团队在《Comparative Immunology Reports》上发表了一项研究，系统地评估了在饲料中添加BAs对克氏原螯虾生长性能、脂质代谢、肠道健康和免疫反应的影响，并深入探究了其抵抗主要病原感染的分子机制。
为了开展这项研究，作者运用了多项关键技术方法。研究使用来自中国山东微山湖的健康克氏原螯虾，将其随机分为对照组和实验组（饲喂添加0.03% BAs的饲料），进行了为期9周的喂养实验。他们通过测定体重、肝胰腺指数(HPI)和甘油三酯(TG)含量来评估生长性能与脂质代谢。利用实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测了与脂质代谢、抗氧化和免疫相关的基因表达水平。通过转录组测序（RNA Sequencing）和生物信息学分析（包括差异基因表达分析、基因本体论(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析），系统探究了BAs对肠道基因表达网络的调控。采用16S核糖体DNA(rDNA)扩增子测序分析了肠道菌群组成和功能变化。通过组织学分析（苏木精-伊红(H&E)染色）观察了肠道结构变化。最后，通过人工感染WSSV和Vp的攻毒实验，并结合存活率统计、免疫基因表达和病原载量检测（如Western blotting检测病毒蛋白VP28），评估了BAs对虾抗病能力的影响。
研究首先揭示了饲喂胆汁酸能增强克氏原螯虾的生长性能。经过9周的BAs饲喂后，BAs组的平均体重显著高于对照组。BAs组虾的肝胰腺指数(HPI)分布更集中且平均值更高，肝胰腺呈现出更明显的黄色，这与其更高的甘油三酯(TG)含量相吻合。qRT-PCR分析显示，BAs补充协调上调了与脂肪酸合成（乙酰辅酶A羧化酶α(ACACA)、脂肪酸合酶(FAS)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)）、脂质吸收（羧肽酶B1(CPB1)、脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL)）和β-氧化（中链酰基辅酶A脱氢酶(ACADM)、激素敏感脂肪酶(HSL)）相关的基因表达，表明BAs增强了虾的脂质积累和利用能力。
随后，研究探讨了膳食BAs补充增强了克氏原螯虾中肠的抗氧化防御和肠道屏障完整性。组织学分析显示，BAs组虾的中肠保持了黏膜层的结构完整性，其纹状缘(Brush Border, BB)更为清晰致密，褶皱(Wrinkle ridges, WR)稳定，表明吸收表面积可能扩大。在分子水平上，BAs组中与氧化应激反应相关的基因（谷胱甘肽S-转移酶(GST)、细胞色素P450(CYP450)）和紧密连接蛋白（闭锁小带蛋白-1(ZO-1)）的表达水平显著上调，这提示BAs增强了虾肠道的抗氧化防御能力和屏障功能。
为系统解析BAs的调控机制，研究人员进行了转录组证据揭示BAs介导的克氏原螯虾中肠营养代谢和免疫通路调控。主成分分析(PCA)显示BAs组与对照组基因表达谱明显分离。差异表达基因(DEGs)分析共鉴定出306个DEGs。GO和KEGG富集分析表明，这些基因主要富集于上皮细胞迁移、葡萄糖代谢调节等生物过程，以及溶酶体、鞘脂代谢、过氧化物酶体等代谢通路，和C型凝集素受体信号、趋化因子信号、MAPK信号等免疫相关信号通路。基因集富集分析(GSEA)进一步证实了C型凝集素受体信号通路、溶酶体、MAPK信号通路和过氧化物酶体在BAs组显著正富集。
基于转录组揭示的免疫通路激活，研究评估了膳食BAs补充增强了克氏原螯虾对WSSV感染的抵抗力。攻毒实验表明，BAs组虾在感染WSSV后的存活率显著高于对照组。在感染后24小时，BAs组肠道中WSSV的衣壳蛋白VP28表达量以及病毒立即早期蛋白1(IE1)的基因表达量均显著降低，说明BAs可能抑制了病毒的复制。同时，两个关键的抗WSSV免疫基因——抗脂多糖因子1(ALF1)和酚氧化酶原(proPO)的转录水平在BAs组显著上调，进一步支持了BAs能增强虾的抗病毒免疫应答。
最后，研究考察了膳食BAs补充对克氏原螯虾肠道菌群及微生物功能的影响。通过16S rDNA测序分析发现，与对照组相比，BAs组虾肠道菌群中变形菌门(Proteobacteria)的相对丰度显著降低，而厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)的丰度显著增加。在口服攻毒Vp后，BAs组虾肠道中的总细菌载量（通过16S rDNA水平反映）和Vp的特异性标志基因ToxR的表达量均显著降低。功能预测分析显示，BAs补充后，与核糖体生物合成、孢子形成、氨基酸代谢和DNA修复相关的通路被预测为上调，而与细菌运动性、鞭毛组装和脂多糖(LPS)生物合成相关的通路则被预测为下调。
结论与讨论部分对上述发现进行了综合阐述。该研究系统证实了BAs作为多功能饲料添加剂在克氏原螯虾养殖中的积极作用：它能有效促进生长并改善脂质代谢，表现为体重增加、肝胰腺指数升高、甘油三酯积累以及脂质代谢相关基因表达上调；它能维持肠道结构的完整性并增强抗氧化防御能力；它能显著重塑肠道菌群，抑制潜在有害菌（如Proteobacteria）并富集有益菌（如Firmicutes和Bacteroidetes），同时预测能抑制细菌运动性和LPS合成；最重要的是，它通过上调关键的免疫基因（如ALF1和proPO）和调节相关免疫信号通路，显著增强了虾对WSSV和Vp这两种重要病原的抵抗力。
该研究的重要意义在于为胆汁酸在甲壳动物水产养殖中的应用提供了全面的理论和实践依据。它揭示了BAs通过多层面、多通路的协同作用——从基础代谢调控到免疫系统激活，再到微生物稳态维护——来综合提升宿主的健康水平和抗逆能力。这为解决当前水产养殖中面临的饲料效率低、病害频发等瓶颈问题提供了一种极具潜力的营养策略。尽管研究也指出了一些局限，例如肠道菌群功能是基于预测、甲壳动物中BAs的具体初级受体尚未明确等，但无疑为后续更深入的机制探索（如利用宏基因组学或代谢组学）和应用推广奠定了坚实基础。总体而言，这项研究强有力地支持了BAs作为一种可持续水产养殖添加剂的价值，有望在提升克氏原螯虾等经济甲壳动物的养殖效益和产业韧性方面发挥重要作用。
