4’-氟尿啶核苷前药的开发以提高耐受性

《European Journal of Medicinal Chemistry》：Development of a Nucleotide Prodrug of 4’-Fluorouridine to Improve Tolerability

抗流感病毒药物4’-氟尿嘧啶（EIDD-2749）前药设计及优化研究。合成15种单磷酸前药，发现EIDD-2838有效但存在对映异构体问题。通过铜介导手性辅助拆分得到单一PS对映体EIDD-3639，在2 mg/kg剂量下仍保持抗H1N1效力。同时开发出多克级制备EIDD-3639的新方法，包括手性催化耦合和硝基苯甲酸辅助结晶。

　　

Austin T. Ryan | Jean-Marc I.A. Lawrence | Brett Virgin-Downey | Damien L. Kuiper | Michael W. Hager | Takashi Tomioka | Raphael S. Kim | Ami H. Asakawa | Mariah C. Meehan | Phong Truong | Shuli Mao | Manohar T. Saindaine | Zachary M. Sticher | José Marengo | Meghan K. Andrews | Rebecca E. Krueger | Amalia Anne Cruz | McKenzie L. Smith | Rui Jin | Deborah G. Mitchell | Michael G. Natchus

埃默里大学药物开发研究所（EIDD），美国佐治亚州亚特兰大，邮编30322

摘要

4’-氟尿苷（4’-FlU；EIDD-2749）是一种已知的广谱嘧啶衍生物，口服给药对多种高致病性病毒有效，包括流感病毒、呼吸道合胞病毒和基孔肯雅病毒。在EIDD-2749的研发过程中，观察到高剂量下小鼠出现胃肠道不良反应和体重下降，这可能是由于该化合物在肠道中迅速转化为活性形式5’-三磷酸所致。为此开展了一项合成研究，旨在开发出具有更好耐受性和持续疗效的EIDD-2749前药衍生物。共合成并评估了15种单磷酸前药，以评估其对A/California/07/2009（H1N1）流感病毒的抗病毒效果。其中，EIDD-2838符合预期要求。组织分布研究表明，使用前药给药时，体内活性5’-三磷酸的总体暴露量较低，尤其是在肠道中的浓度降低了4倍。通过合成方法（利用铜介导的手性辅助剂）分离出EIDD-2838的磷手性异构体，发现只有EIDD-3639（EIDD-2838的P_S异构体）在低剂量（2 mg/kg）下仍对H1N1感染具有抗病毒活性。还开发了一种制备EIDD-3639的替代方法，该方法结合了立体选择性手性催化剂偶联反应和p-硝基苯甲酸辅助结晶技术。

引言

三十多年来，作为病毒编码聚合酶竞争性底物的核苷和核苷酸类似物已成为治疗病毒性感染的基石。(1), (2), (3), (4) 许多这类化合物（如利巴韦林、阿昔洛韦、恩曲他滨和恩替卡韦）可以以游离核苷的形式口服给药；然而，还有一些化合物（如索非布韦、瑞德西韦、替诺福韦艾拉芬胺、布林西多福韦和莫努匹拉韦）需要以前药形式给药，以调整药代动力学特性或克服阻碍游离核苷转化为5’-三磷酸的代谢障碍。(5), (6), (7), (8)

设计核苷前药的常见策略是引入一个化学不稳定的保护基团，以掩盖其活性所需的部位。对于核苷类似物而言，前药可用于修饰核碱基或屏蔽2’、3’和5’羟基，从而抑制磷酸化过程，直到保护基团在作用部位被切割。⁹ 特别开发了含有保护性5’-单磷酸基团的核苷前药，以同时解决毒性和激酶识别率低的问题，因为已知5’-单磷酸化是许多核苷类似物激活的主要障碍。(10), (11) 已有多种针对不同磷酸化机制的5’-单磷酸前药设计，包括BisPOM（双异丙氧基甲基）、ProTide（磷酸酰胺）和cycloSal（环saligenyl酯）等前药。

EIDD-2749是一种广谱嘧啶衍生物，在啮齿类和非啮齿类动物模型中对正负极性RNA病毒（包括SARS-CoV-2（雪貂）、基孔肯雅病毒（小鼠）、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（小鼠）、拉沙热病毒和朱宁病毒（豚鼠）、Heartland病毒（AG129小鼠）、流感病毒（雪貂）以及呼吸道合胞病毒（小鼠）均显示出良好的口服疗效。¹⁴然而，在高剂量下，不同动物物种会出现体重下降和胃肠道不良反应，这可能是由于该化合物在肠道吸收过程中迅速转化为活性5’-三磷酸并在肠道细胞中积累所致。本文报道了一系列基于5’-单磷酸的EIDD-2749类似物的设计、合成和生物学评估，旨在通过减少其在肠道中的积累来改善耐受性。值得注意的是，我们描述了一种高效的方法，用于制备EIDD-2749的一种环sal前药的单一目标异构体。

结果与讨论

EIDD-2749前药衍生物的合成始于制备含有2’、3’羟基保护基团的常见中间体（方案1A）。从尿苷1开始，首先在5’位进行碘化处理得到碘化物2，随后通过4’,5’-消除反应和全局乙酰化得到3。此步骤中的乙酰化操作便于后续沉淀处理，无需使用色谱技术。为了获得4，还需进行额外的脱保护步骤。

结论

本研究旨在筛选出一种在pdm09 IAV感染小鼠模型中具有更好耐受性和更强抗病毒疗效的EIDD-2749前药。结果显示，EIDD-2838（一种磷手性异构体混合物）是合适的前药候选物，并对其进行了进一步研究。为了分离出各个异构体，我们开发了一种具有高纯度的手性分离方法，成功获得了两种异构体。EIDD-3639（即EIDD-2838的P_S异构体）

CRediT作者贡献声明

Raphael Kim：研究工作。Takashi Tomioka：研究工作。Michael Hager：研究工作。Damien Kuiper：写作、审稿与编辑、研究工作。Michael Natchus：写作、审稿与编辑、资金获取、概念构思。Phong Truong：研究工作。Mariah Meehan：研究工作。Ami Asakawa：研究工作。José Marengo：研究工作。Zachary Sticher：研究工作。Manohar Saindaine：研究工作。Shuli Mao：研究工作。McKenzie Smith：研究工作。Amalia Anne Cruz：

数据可用性声明

作者声明，本研究的支持数据详见论文及其补充信息。

利益冲突声明

?作者声明以下可能构成潜在利益冲突的财务关系/个人关系：George R. Painter是专利WO 2019/1736002的共同发明人，该专利涉及EIDD-2749及其类似物作为抗病毒药物的用途；Damien L. Kuiper、Shuli Mao、Michael G. Natchus和George R. Painter是专利WO 2024/233354的共同发明人，该专利涉及EIDD-3639和EIDD-3640及其作为抗病毒药物的用途。

致谢

本研究部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）/国家传染病研究所（NIAID）的Public Health Service资助（项目编号AI171403）以及Medical CBRN Defense Consortium（MCDC）的资助（项目编号MCDC2005-005）。同时，感谢埃默里大学X射线晶体学中心在获取10和EIDD-3639晶体结构方面提供的帮助。