《Experimental Eye Research》：Berberine inhibits muramyl dipeptide-induced oxidative stress and pyroptosis in canine corneal epithelial cells via the NOD2 signaling pathway
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本研究发现，muramyl dipeptide（MDP）通过激活NOD2依赖的RIPK2/NF-κB通路，抑制Nrf2介导的抗氧化响应，加剧犬角膜上皮细胞的氧化应激，促进NLRP3炎症小体组装及caspase-1激活，引发gasdermin D介导的焦亡。天然化合物berberine（BBR）可有效抑制NOD2信号，恢复氧化还原平衡，抑制炎症小体组装和焦亡，并在细胞及犬模型中显示治疗效果。揭示了MDP通过NOD2通路整合氧化应激和焦亡加剧角膜损伤的机制，并证实BBR作为多靶点治疗剂的价值。
梁玉轩|谢晓昌|李学瑞|宋晓坤|周申东|薛天仪|沈向珍
中国江苏省南京市南京农业大学兽医学院动物健康与食品安全联合国际研究实验室（教育部资助）
摘要
细菌性角膜炎对伴侣动物（尤其是狗）的视力健康构成严重威胁，常导致角膜溃疡和视力障碍。鼠李糖二肽（MDP）是一种保守的细菌肽聚糖结构，能够激活含有核苷酸结合寡聚化结构域的蛋白2（NOD2），但其对角膜病理过程的贡献尚不完全清楚。本研究证明，MDP通过诱导NOD2依赖性的RIPK2/NF-κB通路激活，引发促炎细胞因子的产生并抑制Nrf2介导的抗氧化反应，从而加剧犬角膜上皮细胞的氧化应激。此外，MDP还促进NLRP3炎性小体的形成、caspase-1的激活以及gasdermin D介导的焦亡。抑制NOD2信号通路可减轻这些效应，表明其在协调炎症和氧化损伤中的核心作用。值得注意的是，天然化合物小檗碱（BBR）能有效抑制NOD2的激活，恢复氧化还原平衡，并在MDP诱导的角膜炎细胞模型和犬模型中抑制焦亡。这些结果揭示了MDP通过NOD2驱动的氧化应激与焦亡整合来加剧角膜损伤的先前未被认识的作用机制。我们还发现BBR是一种多靶点治疗剂，能够干扰这一致病级联反应。我们的发现为通过调节先天免疫信号通路治疗细菌性角膜炎提供了机制上的见解。
引言
细菌性角膜炎是动物中常见的眼科疾病，尤其是在狗中，机会性病原体会利用角膜损伤引发严重的炎症反应（Z. Wang等，2024）。当鼠李糖二肽（MDP）作用于眼表时，这种来自细菌肽聚糖的关键病原相关分子模式（PAMP）会在兔子中引起结膜炎和葡萄膜炎（Langford等，2013），在老鼠中触发结膜细胞凋亡（Langford等，2023），并促进角膜新生血管形成（Kim等，2013）。作为先天免疫系统的强效激活剂，MDP主要通过细胞内的核苷酸结合寡聚化结构域蛋白2（NOD2）发挥作用，引发与多种物种的多种系统性和自身免疫性疾病相关的促炎信号级联反应（Masaki等，2024）。尽管有广谱抗生素和抗炎药物可用，但目前的治疗策略仍存在局限性：多重耐药菌株的出现、无法在不抑制保护性免疫的情况下特异性对抗MDP驱动的炎症，以及缺乏有效调节NOD2信号通路的靶向药物（Ohto，2022）。因此，详细了解MDP加剧角膜损伤和维持炎症级联反应的分子机制对于开发针对犬患者的新颖、病原体特异性的干预措施至关重要。
NOD2信号通路的失调与多种免疫和炎症性疾病（包括炎症性肠病、Blau综合征和葡萄膜炎）的易感性增加有关（Philpott等，2014）。NOD2识别其配体MDP后，会招募受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶2（RIPK2），进而激活核因子κB（NF-κB）。这一转导过程会上调关键的促炎介质的转录，尤其是非活性的前体pro-IL-1β和NLRP3蛋白。随后，在ATP或活性氧（ROS）等第二信号的存在下，这些成分会促进NLRP3炎性小体的形成，催化pro-IL-1β切割为其活性形式，并触发一种高度炎症性的程序性细胞死亡——焦亡（Cai，2025）。焦亡作为一种关键的“执行信号”，通过释放损伤相关分子模式（DAMPs）和成熟细胞因子来放大炎症级联反应（Kovacs & Miao，2017）。虽然NOD2炎症通路被认为是细菌性角膜炎中过度和破坏性炎症的核心驱动因素，但其在犬角膜微环境中的具体作用和调控机制仍不明确。
新兴证据表明，氧化应激（表现为ROS过度产生和抗氧化防御能力下降）是连接微生物侵袭与免疫激活失调的关键病理桥梁（Cui等，2014）。值得注意的是，MDP的识别会通过NOD2介导的NADPH氧化酶激活直接增加细胞内ROS的生成（Cheng等，2018；Maurya等，2015）。这种氧化还原失衡不仅促进了NLRP3炎性小体的形成（NLRP3是焦亡的关键传感器，Zhou等，2011），还通过gasdermin D介导的孔洞形成和质膜破裂加剧了炎症性细胞死亡（Z. Wang等，2024）。此外，氧化应激通过激活NF-κB等氧化还原敏感的转录因子，进一步增强了炎症信号传导，从而形成了炎症和组织损伤的自我循环（Sul & Ra，2021）。尽管最近的研究表明氧化应激与角膜炎症之间存在潜在的相互作用，但大多数现有研究仅限于体外模型或系统性疾病。
小檗碱（BBR）是一种从药用植物如Coptis chinensis中提取的天然异喹啉生物碱，因其多种药理特性（包括广谱抗菌、抗炎和抗氧化作用）而受到广泛关注（Gasmi等，2024）。最新研究证实了BBR对多种生物系统中多种信号通路的强大调节作用。特别是在代谢紊乱、胃肠道炎症和神经退行性疾病中，它通过调节NF-κB和NLRP3炎性小体轴来减轻过度的免疫激活和细胞损伤（Sarbadhikary等，2021）。在眼科研究中，BBR在干眼症（Han等，2023b）和糖尿病视网膜病变（Yang等，2024）模型中显示出有希望的治疗潜力，主要通过抑制促炎细胞因子的产生和减少氧化应激。尽管在犬模型中的研究表明BBR对代谢紊乱和胃肠道炎症等系统性疾病有效（Feng等，2018），但其在犬眼疾病（尤其是细菌性角膜炎和MDP驱动的病理过程中）的治疗潜力仍需进一步探索。基于这些因素，本研究旨在系统探讨MDP-NOD2-焦亡轴在犬细菌性角膜溃疡发病机制中的作用，并通过体外和体内实验评估BBR在干扰炎症放大和恢复角膜稳态方面的治疗潜力。
材料
MDP（53678-77-6）购自InvivoGen（美国加利福尼亚州圣地亚哥）。BBR（B875003）购自Macklin Biochemical Co., Ltd.（中国上海）。2-BP（238422）购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。Zoletil购自Virbac（美国密苏里州圣路易斯）。所有其他试剂均为分析级。
细胞培养和处理
原代犬角膜上皮细胞（CCECs）按照先前的方法体外分离并培养（Guo等，2022）。细胞在湿润环境中培养
MDP以剂量依赖性方式激活NOD2信号通路
如图S1A–C所示，用不同浓度的MDP处理CCECs 12小时后，细胞损伤逐渐加重。值得注意的是，MDP处理引发了典型的焦亡形态特征（图S1C，红色箭头）。对这些形态变化的定量分析证实了焦亡细胞比例随浓度的增加而增加（图S1D）。
讨论
细菌性角膜炎对伴侣动物（尤其是狗）来说可能是一种危及视力的眼科急症，通常由创伤性损伤、微生物感染或角膜完整性受损引起（Z. Wang等，2024）。其病因主要是细菌性的，如铜绿假单胞菌和葡萄球菌等病原体常与溃疡性角膜炎相关（Krecny等，2015；Wang等，2008；Z. Wang等，2022）。当角膜上皮受损时
结论
总体而言，我们的结果表明，MDP诱导的NOD2激活通过抑制NRF2介导的抗氧化反应来促进氧化应激，从而促进NLRP3炎性小体的激活和焦亡。BBR通过抑制NOD2信号通路、恢复NRF2活性以及抑制炎性小体的形成和焦亡，有效中断了这一级联反应。氧化应激与炎症信号之间的相互作用加剧了角膜损伤。BBR作为一种多靶点治疗剂表现出良好的效果
CRediT作者贡献声明
谢晓昌：方法学、数据管理。李学瑞：方法学、数据管理。宋晓坤：方法学。周申东：方法学。梁玉轩：撰写初稿、研究、正式分析、数据管理。薛天仪：方法学。沈向珍：撰写、审稿与编辑、项目管理、资金获取、概念构思
未引用参考文献
Wang等，2022；Wang等，2024。
利益冲突声明
? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：32373087和32172933）的支持。
我们感谢扬州大学兽医学院的李建基教授和郭龙博士在原代细胞培养技术方面的指导。
