口服干扰素-γ（IFN-γ）可诱导抗病毒免疫力，并增强大口黑鲈（Micropterus salmoides）对LMBV（一种病毒）的防护效果

《Fisheries Research》：Oral administration of IFN-γrel elicits antiviral immunity and enhances protective efficacy against LMBV in largemouth bass ( Micropterus salmoides)

largemouth bass病毒（LMBV）防控中，口服型II型干扰素γ相关基因（IFN-γrel）的表达、结构特征及抗病毒活性研究。通过克隆与功能分析，证实该基因缺乏核定位信号但具有典型干扰素特征，体外显著抑制病毒基因表达，口服递送后能上调ISG15、Mx等抗病毒基因表达，提高血清抗病毒活性。预防性给药使生存率（RPS）达40%，治疗性给药后RPS为31.6%，均有效抑制病毒复制并减轻脾脏和肝脏病理损伤，同时降低TNF-α、IL-8等炎症因子表达。该研究为鱼类病毒性疾病的口服干扰素疗法提供理论依据。

　　

张泽淼|杨森|张轩|刘俊成|徐涛|冼洁敏|黄友华|秦启伟|周胜

中国华南农业大学海洋科学学院，广州，510642

摘要

大口黑鲈病毒（LMBV）对全球水产养殖构成了严重威胁，但有效的抗病毒策略仍然有限。本研究表征了II型干扰素IFN-γrel在大口黑鲈中的抗病毒特性，并通过口服给药方式评估了其预防和治疗效果。大口黑鲈IFN-γrel（MsIFN-γrel）的开放阅读框（ORF）序列为564 bp，编码188个氨基酸，包括一个N端信号肽和一个C端IFN-γ特征序列；它缺乏核定位信号。我们的研究结果表明，过表达MsIFN-γrel可以降低病毒基因（MCP和DNMT）的mRNA和蛋白质水平，从而证实了其在体外的抗LMBV活性。通过口服枯草芽孢杆菌表达的重组MsIFN-γrel蛋白，可以上调IFN-γrel、Mx和ISG15的表达，增强大口黑鲈的血清抗病毒活性。在LMBV感染后，预防性治疗的相对存活率（RPS）为40.0%，而PBS组仅为29.1%。MsIFN-γrel减轻了脾脏和肝脏的组织损伤，降低了促炎基因（TNF-α和IL-8）的表达，并限制了LMBV的复制。与PBS组相比，增加MsIFN-γrel的剂量可使RPS从29.1%提高到65.1%。重要的是，LMBV感染后给予MsIFN-γrel的治疗显著提高了存活率，达到31.6%。这种治疗在体内显著抑制了LMBV的复制，减轻了脾脏和肝脏组织的病理损伤，并降低了促炎基因（TNF-α和IL-8）的表达。由于其非侵入性和易于实施的特点，口服给药在水产养殖应用中具有明显的实际优势。总体而言，我们的结果表明MsIFN-γrel具有强大的抗LMBV活性，其口服给药是一种方便且有效的方法，可用于预防和治疗大口黑鲈的水产养殖感染。

引言

大口黑鲈是中国重要的水产养殖物种，因其肉质优良、养殖周期短以及高度的环境适应性而受到重视，到2024年其年产量已超过938,500吨。然而，随着养殖规模和密度的增加，疾病问题变得越来越严重。LMBV属于Iridoviridae科和Ranavirus属，是一种双链DNA病毒，具有二十面体结构，大小为104–140 kbp，已成为大口黑鲈养殖中最严重的病毒威胁之一。LMBV具有高度传染性和致病性，可通过口服、浸泡和注射传播。LMBV感染后，临床症状表现为色素沉着加深、注射部位炎症和坏死，腹部膨胀、螺旋状游动行为以及侧卧。此外，受感染的鱼类肝脏呈局部苍白，脾脏呈鲜红色，肠系膜呈红色。将LMBV腹腔注射到大口黑鲈体内后，病毒在脾脏和肝脏中大量复制，伴随典型的病理学变化。与细胞死亡相关的途径参与了LMBV感染，其中促炎因子TNF-α显著增加。目前，市场上还没有专门针对LMBV的抗病毒药物。LMBV的预防和治疗仍然依赖于改进的生物隔离措施、苗种检疫、渔业管理和消毒协议。

干扰素（IFNs）是先天免疫系统中的关键细胞因子，在通过诱导抗病毒基因表达和调节免疫反应（如ISG15和Mx基因）方面发挥核心作用。在哺乳动物中，IFNs分为I型、II型和III型；而在硬骨鱼类中，IFNs分为I型、II型和IV型。在硬骨鱼类中，II型IFNs包括两个成员：IFN-γ和IFN-γ相关基因（IFN-γrel）。与哺乳动物的IFN-γ不同，硬骨鱼类的IFN-γrel缺乏由四个连续阳离子残基（赖氨酸和精氨酸）组成的C端核定位信号（NLS）序列，这一序列在硬骨鱼类和哺乳动物的IFN-γ分子中都是保守的。尽管IFN-γ和IFN-γrel在结构上存在差异，但这两种II型IFN在调节干扰素刺激基因（ISGs）表达和抵御微生物感染方面表现出相似的功能。IFN-γrel基因的抗病毒活性已在多种病毒中得到验证。在锦鯉中，IFN-γrel对致命锦鯉造血坏死病毒（CHNV）显示出强效活性；Siniperca chuatsi的IFN-γrel对传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）有效；海鲈（Lateolabrax japonicus）的IFN-γrel对红斑石斑鱼神经坏死病毒（RGNNV）也显示出一定的活性。

与药物注射相比，口服给药提供了一种方便且非侵入性的替代方法。在小鼠模型中，口服给药后可以在血浆中检测到IFN蛋白。在大西洋鲑鱼（Salmo salar）中，口服I型干扰素可显著降低传染性胰腺坏死病毒（IPNV）的负荷，并显著增加脾脏中Mx和PKR基因的表达。此外，口服IFN-γ还能显著刺激血清溶菌酶活性，并上调脾脏和肾脏中IL-6、IFN-γ和IL-12基因的表达。口服干扰素（IFN）的抗病毒效果已在虹鳟（Oncorhynchus mykiss）、普通鲤鱼（Cyprinus carpio）和草鱼（Ctenopharyngodon idella）中得到证实。这种方法显著提高了感染传染性造血坏死病毒（IHNV）、鲤鱼春季病毒血症（SVCV）和草鱼出血病毒（GCHV）后的相对存活率。

在这项研究中，我们克隆并功能表征了大口黑鲈的IFN-γrel。我们评估了IFN-γrel在细胞水平上对LMBV的体外抗病毒效果。此外，我们使用枯草芽孢杆菌系统表达了IFN-γrel，并评估了口服给药的IFN-γrel在体内的抗LMBV效果。我们还评估了大口黑鲈在口服IFN-γrel后的血清抗病毒活性。最后，我们确定了口服IFN-γrel的剂量依赖性效果，并比较了其在预防和治疗LMBV感染方面的保护作用。这些发现为大口黑鲈中基于IFN的抗病毒免疫奠定了基础。

实验动物、细胞和病毒

本研究中使用的大口黑鲈（5.1 ± 0.4 g，7.2 ± 1.3 cm）来自一家商业水产养殖公司（中国广东省佛山市），并通过PCR检测确认未感染LMBV。这些鱼被饲养在300 L的鱼缸中，保持稳定的温度25 ± 1 °C。实验前，它们至少适应了七天，并每天喂食两次商业干饲料。脂肪头鲦鱼（FHM）细胞在Leibovitz's L-15培养基（Gibco, Invitrogen Life）中培养。

同源性比对和系统发育分析

MsIFN-γrel的ORF长度为564 bp，编码188个氨基酸。多组氨基酸序列比对显示，MsIFN-γrel具有N端信号肽和C端IFN-γ特征序列，但缺乏NLS。这一显著区别与另一种大口黑鲈II型干扰素Micropterus salmoides IFNγ（图1A）不同。MsIFN-γrel与Siniperca chuatsi IFNγrel和Epinephelus coioides IFNγrel的序列相似度分别为78.9%和70.7%。

讨论

由于LMBV的研究刚刚开始，有效的预防和治疗策略仍然缺乏。尽管IFNs在人类医学中是公认的抗病毒物质，但其在LMBV上的应用研究尚不足。鱼类研究表明，口服IFN可以显著降低全身病毒负荷并引发广泛的抗病毒免疫。然而，大口黑鲈的IFN-γrel尚未被报道，其抗病毒活性也不清楚。因此，我们对其进行了克隆和功能表征。

作者贡献声明

张泽淼：实验设计和执行，初稿撰写，数据整理。杨森：实验执行。张轩：实验执行。刘俊成：实验执行。徐涛：实验执行。冼洁敏：实验执行。黄友华：撰写、审稿与编辑，监督。秦启伟：监督、审稿与编辑、资金获取、资源协调。周胜：监督、撰写、审稿与编辑、资金获取、资源协调。

致谢

本研究得到了广东省重点领域研究与发展计划（项目编号2021B0202040002）、SCBM和SCAU联合研发的大口黑鲈病毒（LMBV）亚单位疫苗项目，以及南沙-华南农业大学渔业研究所（NSYYKY202304）专项科学基金的资助。