热灭活长双歧杆菌CECT 7347 (ES1 HT)的90天大鼠口服毒性研究

《Food and Chemical Toxicology》：A 90-day oral toxicity study of heat-treated Bifidobacterium longum CECT 7347 (ES1 HT) Postbiotic in rats

为评估新型热灭活后生元（postbiotic）的安全性，研究人员开展了一项为期90天的大鼠口服毒性研究。研究采用热灭活长双歧杆菌CECT 7347 (ES1 HT)进行测试，结果显示，在最高测试剂量下（每日1000 mg/kg，相当于5×1010CFUeq/kg），未观察到任何与处理相关的毒性效应。该结果为该后生元成分在食品和膳食补充剂应用中的长期安全性提供了重要支持。

　　

随着人们对肠道健康的日益关注，益生菌（probiotics）已广为人知，成为酸奶、补充剂中的常见成分。然而，活菌产品面临着保质期、储存和运输的挑战。一种解决思路是使用“后生元”（postbiotics）——即通过热处理等方式灭活后的微生物细胞及其成分，它们同样被证明对宿主健康有益。但一个关键问题随之而来：经过“杀死”处理的微生物，其长期食用的安全性究竟如何？是否与活菌一样安全？为了回答这个问题，研究者们将目光投向了一种特定的菌株：长双歧杆菌CECT 7347 (ES1)。该菌株本身已通过多项体外研究和短期动物实验证明了其安全性。那么，将其制成热灭活的后生元版本——热灭活长双歧杆菌CECT 7347 (ES1 HT)后，长期摄入是否仍然安全呢？这正是《Food and Chemical Toxicology》期刊上发表的这项研究致力于回答的核心问题。

研究人员为了评估ES1 HT的长期食用安全性，开展了一项标准化的90天重复剂量口服毒性研究。该研究参照经济合作与发展组织（OECD）的测试指南（TG 408）设计，采用健康、未受试的Wistar大鼠作为模型动物。研究团队将大鼠分为对照组和测试组，每组包含10只雄鼠和10只雌鼠。对照组每日通过口服灌胃给予作为载体的木薯麦芽糊精（剂量为1000 mg/kg体重），而测试组则每日灌胃给予相同剂量的热灭活ES1 HT（浓度为5×10¹⁰CFUeq/g，即每日5×10¹⁰CFUeq/kg）。研究期间，对大鼠进行了全面的观察和检测，以寻找任何潜在的毒性迹象。

本研究主要采用了以下关键技术方法：首先是基于OECD TG 408指南的90天重复剂量口服毒性实验设计，这是评估化学品和生物制剂亚慢性毒性的国际金标准。其次是动物模型的使用，研究选用Wistar大鼠作为受试对象，每组10只/性别，共20只。第三是全面系统的毒性终点评估体系，包括详细的临床观察、体重与摄食/摄水量监测、前肢抓力测试、临床生化与血液学分析、尿液分析、甲状腺激素检测、器官称重以及涵盖多个器官系统的组织病理学检查。第四是严格的统计分析，使用IBM SPSS Statistics软件，通过Grubbs检验剔除异常值，并采用双向方差分析（ANOVA）和Student t检验来评估性别、处理及其交互作用的影响，显著性阈值设定为p < 0.05。

研究结果

3.1. 临床观察

在整个研究过程中，所有动物均保持健康，无死亡记录。每日的临床观察（包括详细的行为、外观和对外部刺激的反应评估）均未发现与测试物质相关的异常。偶有动物前爪出现脱毛，但这在对照组和测试组中均有零星发生，被认为是该年龄和品系实验室啮齿动物在亚慢性毒理学研究中的常见现象，与处理无关。

3.2. 体重、食物和水的消耗

所有动物的体重均按预期逐渐增加，同一性别内，处理组与对照组动物之间无明显差异。统计分析显示，体重和体重增长存在显著的性别差异，这与预期相符，且与处理无关。食物消耗量同样显示出预期的性别差异（雄性消耗更多）。在水的摄入方面，尽管在研究的第50天和第71天，服用ES1 HT的雌性大鼠饮水量低于雌性对照组，但这些差异被认为是零星的、非剂量相关的，且在不同性别和时间点缺乏一致性，因此被判定为非不良事件且与处理无关。

3.3. 抓力评估

前肢抓力测试未观察到与处理相关的差异。如预期一样，雄性大鼠的抓力显著高于雌性。

3.4. 尿液分析

尿液分析参数（包括尿量、外观和肌酐水平）未发现与处理相关的差异。尿量和水摄入量存在显著的性别差异，雄性均高于雌性。

3.5. 血液学评估

在所有评估的血液学参数中，未观察到具有生物学意义的差异。在服用ES1 HT的雄性和雌性大鼠中观察到的平均血小板体积（MPV）略有升高（p<0.05），但变化幅度很小（≤ 5%），因此不被认为是生物学相关的变化。许多参数（如白细胞计数、红细胞计数等）存在性别差异，这是常见的生物学现象。

3.6. 临床生化评估

所有评估的临床生化参数，包括甲状腺激素（三碘甲状腺原氨酸T3、甲状腺素T4和促甲状腺激素TSH）分析，均未发现与处理相关的差异。在血糖、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、白蛋白、T4和TSH水平上观察到预期的性别差异。

3.7. 器官重量

器官重量未发现与处理相关的差异。由于雄性和雌性大鼠体型存在显著差异，大多数评估的器官都显示出预期的性别差异。

3.8. 组织病理学评估

对所有列出的器官进行的组织病理学评估中，未发现不良或与处理相关的效应。大多数显微镜下观察到的病变均为轻微程度，且在对照组和测试组中的发生率和严重程度相当。例如，心脏中观察到的软骨样化生和（一例）瓣膜粘液样变性是Sprague-Dawley大鼠常见的年龄相关变化。在胃肠道（十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠）中普遍报告的粘膜内微钙化是常见的背景性变化。胰腺导管腺瘤（对照组一例雄性）和轻度淋巴聚集（测试组两例雄性）也被认为是实验室大鼠常见的背景病变，并非处理相关效应的指征。

结论与意义

本研究得出结论，在为期90天的重复剂量口服暴露中，热灭活长双歧杆菌CECT 7347 (ES1 HT)在雄性和雌性Wistar大鼠中的无可见有害作用水平为每日5×10¹⁰CFUeq/kg（1000 mg/kg极限剂量）。研究中未观察到任何与处理相关的毒性效应。

这一结果具有多重重要意义。首先，它直接证实了这种特定后生元在长期摄入情况下的安全性，弥补了关于热灭活益生菌后生元长期毒理学数据相对有限的现状。其次，该研究为长双歧杆菌CECT 7347菌株及其后生元形式的安全性证据链增添了关键一环。该菌株所属的物种长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）本身已在美国被普遍认为安全，并在欧盟拥有合格推定安全资格，且该菌株已通过体外研究和急性动物实验证明了其安全性。本研究则通过标准化的亚慢性毒性试验，进一步巩固了其安全基础。

此外，研究讨论部分指出，鉴于长双歧杆菌广泛的安全使用历史、QPS地位以及菌株特异性安全数据，在进行膳食风险评估时，可能无需对从本研究的NOAEL推导出的安全摄入水平应用传统的100倍安全系数。计算表明，测试剂量（5×10¹⁰CFUeq/kg/天）换算到70公斤人体，相当于每日3.5×10¹²CFUeq，这远超了该成分在食品和补充剂中预期使用剂量（每份1×10¹⁰至1×10¹¹CFUeq）的保守估计。研究还援引了已发表的人体临床试验，证明ES1 HT在肠易激综合征腹泻型和有轻微消化不适的健康成人中具有良好的安全性和耐受性。

因此，这项90天大鼠毒性研究作为确证性证据，与物种的安全使用历史、菌株特异性安全数据以及现有的人体临床数据相结合，共同构成了强有力的证据权重，支持将热灭活长双歧杆菌CECT 7347 (ES1 HT)安全地应用于食品和膳食补充剂产品中，为这一新兴的后生元类别产品的安全评估和商业化应用提供了坚实的科学依据。