《Food Bioscience》：Immunoprotective Effects of
Lacticaseibacillus casei OS1423 Against Transient Immunosuppression via Enhancement of Host Immunity and Gut Microbiota Modulation
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本研究通过筛选931株益生菌，确定4株具有免疫调节和肠道菌群平衡功能的菌株，其中OS1423在环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠模型中表现出显著保护作用，通过激活巨噬细胞、增强T/B细胞增殖及调节血清免疫球蛋白和炎症因子水平，同时验证其安全性符合国际标准。
姜友京（Yoo-Kyung Kang）| 金友泰（You-Tae Kim）| 权俊基（Joon-Gi Kwon）| 金惠珍（Hye-Jin Kim）| 李珠贤（Joo Hyun Lee）| 姜春吉（Choon Gil Kang）| 金成旭（Seung Wook Kim）| 李朱勋（Ju-Hoon Lee）
韩国首尔国立大学农业生物技术系
摘要
益生菌因其调节免疫反应的能力而受到越来越多的认可，但其特定菌株的有效性和安全性对于其应用至关重要。本研究旨在识别能够抵御短暂免疫抑制的免疫调节益生菌。共筛选了931种益生菌菌株，以检测它们在巨噬细胞中诱导一氧化氮的能力，最终选出了196种候选菌株。通过评估其耐氧性和耐热性、胃肠道存活能力以及细胞因子的产生情况，选择了四种菌株：Lacticaseibacillus casei OS1423、L. paracasei OS1213、Limosilactobacillus fermentum SLfe039和Bifidobacterium longum SBLO386。这些菌株表现出符合国际监管标准的严格安全性，这通过缺乏抗生素抗性基因、无溶血活性和无细胞毒性得到了证实。在环磷酰胺（CP）诱导的免疫抑制小鼠模型中，OS1423表现出最强的免疫保护作用。OS1423的给药有效减轻了体重下降，保持了脾细胞数量，恢复了自然杀伤（NK）细胞活性，并促进了T/B细胞的增殖。血清免疫球蛋白水平（IgA和IgG）以及脾细胞和结肠组织中的细胞因子表达显著受到保护，免受CP处理的影响。微生物组分析显示，OS1423的预先给药可以缓解CP引起的肠道菌群失调，抑制了与炎症相关的菌属（Ruminococcus和Alistipes），同时保持了有益的菌属（如Anaeroplasma），这与免疫标志物相关。这项在体外、离体和体内平台上进行的全面评估表明，OS1423通过调节宿主免疫反应和肠道微生物群组成来发挥强大的免疫保护作用。这些发现支持将其作为功能性食品成分或治疗辅助手段，用于在短暂免疫抑制条件下支持免疫健康。
引言
益生菌是活的微生物，当以适当剂量给予时，可以对宿主产生健康益处（Hill等人，2014年）。大多数益生菌主要基于乳酸菌（LAB）。乳酸菌是无孢子的、革兰氏阳性的、厌氧或兼性需氧细菌，其主要发酵产物之一是乳酸（Latif等人，2023年）。在韩国，食品和药品安全部（MFDS）将19种菌株归类为益生菌：11种Lactobacillus（L. acidophilus、L. gasseri、L. delbrueckii ssp. bulgaricus、L. helveticus、Lacticaseibacillus casei、Lacticaseibacillus paracasei、Lacticaseibacillus rhamnosus、Limosilactobacillus fermentum、Limocilactobacillus reuteri、Lactiplantibacillus plantarum和Ligilactobacillus salivarius）、1种Lactococcus（Lc. lactis）、2种Enterococcus（E. faecium和E. faecalis）以及1种Streptococcus（S. thermophilus）、4种Bifidobacterium（B. bifidum、B. breve、B. longum和B. animalis ssp. lactis）。
益生菌具有多种潜在的健康益处，如改善血液循环、降低胆固醇、增强认知功能、保护肝脏健康、保护眼睛健康、缓解肥胖、抑制多重耐药性病原体、缓解乳糖不耐受等（Kerry等人，2018年；Latif等人，2023年）。随着现代社会的发展，诸如衰老、压力、感染、药物、睡眠问题和生活方式等因素导致免疫功能障碍的情况日益增多，因此需要特别关注免疫系统的管理（Fan & Pedersen，2021年）。这些因素与免疫功能减弱和肠道微生物群失调密切相关（Zheng等人，2020年）。有趣的是，经常有报道称，通过恢复胃肠道中的肠道微生物群平衡，益生菌可能有助于增强人体免疫系统（Zheng等人，2020年），这表明益生菌在调节人体免疫系统中可能起着关键作用。基于这些发现，已经开发出多种益生菌来支持人体免疫系统，并将其纳入与免疫相关的功能性食品中。然而，益生菌活性与宿主免疫调节之间的潜在机制尚未完全明了。因此，需要进一步的研究来阐明益生菌的免疫调节作用及其与宿主免疫途径的相互作用。
根据其对宿主免疫反应的影响，免疫调节益生菌可以大致分为两种功能类型。增强免疫的菌株通过激活树突状细胞、巨噬细胞和自然杀伤（NK）细胞，以及促进促炎细胞因子（如白细胞介素（IL）-12和干扰素-γ（IFN-γ）和分泌型IgA等免疫球蛋白的分泌来刺激先天性和适应性免疫系统。例如，Lacticaseibacillus rhamnosus GG已被证明可以增强NK细胞活性并增加外周血单核细胞中的IFN-γ产生，从而促进Th1偏向的免疫反应（H. Wang等人，2016年）。同样，Lactiplantibacillus plantarum RS-09已被证明可以激活宿主免疫细胞上的Toll样受体2（TLR2），触发NF-κB信号通路，导致促炎细胞因子（如TNF-α和IL-6）的上调，这些细胞因子对于启动黏膜免疫至关重要（Zhao等人，2022年）。B. longum subsp. longum BB536也被报道可以增加唾液中的IgA水平并提高老年人的流感疫苗反应性（C. Xu等人，2024年）。相反，稳定免疫的菌株通过增强上皮屏障功能、诱导调节性T（Treg）细胞以及促进抗炎细胞因子（如IL-10和转化生长因子-β（TGF-β）的产生来发挥抗炎作用。Limosillactobacillus reuteri DSM 17938已被证明可以调节Th17/Treg平衡并增强IL-10的产生，从而有助于维持黏膜免疫耐受性和肠道稳态（Liu等人，2019年）。在结肠炎的小鼠模型中，B. breve M-16V通过增强屏障完整性和下调促炎细胞因子（如IL-6和IL-1β）来减轻炎症（Niu等人，2022年）。此外，Lacticaseibacillus paracasei GM-080在临床上已被证明可以减少Th2相关的炎症并显著改善过敏性鼻炎患者的症状（E.-K. Lin等人，2023年）。鉴于由于衰老、压力、不良饮食和久坐生活方式等原因导致的免疫失衡日益普遍，对具有免疫增强特性的益生菌的需求正在增长。在这些益生菌中，具有增强免疫特性的益生菌对于提高免疫警觉性和改善宿主防御机制尤为重要。
然而，尽管益生菌已被证明有效，但确保其基本安全性仍然是将其作为功能性食品成分使用的一个关键且不可妥协的前提。无论目标消费者是谁，包括世界卫生组织（WHO）、联合国粮食及农业组织（FAO）、欧洲食品安全局（EFSA）和美国食品药品监督管理局（FDA）在内的国际监管机构都制定了严格的安全标准，这些标准必须在任何人类应用之前得到满足（EFSA添加剂和动物饲料中使用的物质小组，2018年；FAO & WHO，2002年；FDA，2024年）。这些指南要求所有新的益生菌候选物必须经过严格评估，以排除潜在风险，如抗生素抗性基因的转移、溶血活性或细胞毒性，从而保证其适合人类消费。因此，本研究优先验证了这些基本安全参数，符合标准化的全球协议。在韩国，由于MFDS在2020年首次制定了益生菌的安全指南，益生菌的安全评估变得尤为重要。特别是考虑到本研究旨在缓解免疫抑制，确保没有抗生素抗性、毒力因子和溶血活性对于预防机会性感染至关重要（Bang等人，2021年；Yang等人，2019年）。因此，本研究严格遵循这些标准化的评估程序来评估所选益生菌的安全性。
本研究的主要目标是识别和表征具有优异免疫调节特性的益生菌菌株，并阐明其涉及宿主-微生物群相互作用的特定菌株机制。为此，通过系统的逐步筛选过程选择了特定菌株。该过程首先从评估一氧化氮（NO）的产生开始，将其作为免疫刺激潜力的主要指标。由于NO是由活化的巨噬细胞分泌的关键信号分子，用于启动先天免疫和病原体防御，其产生能力是一个可靠的生物标志物，反映了菌株触发早期免疫反应的能力，并与促炎细胞因子的分泌密切相关（Lee等人，2022年；J. Wang等人，2020年）。在严格评估了加工稳定性、胃肠道存活能力和安全性之后，最终候选菌株在环磷酰胺（CP）诱导的免疫抑制小鼠模型中进行了验证，以确定它们恢复免疫稳态和调节肠道微生物群组成的能力。这些发现旨在支持将这些菌株作为功能性成分用于增强免疫健康。
细菌菌株和培养条件
本研究中的所有益生菌菌株均来自首尔国立大学食品微生物组实验室的培养收藏。为了确保所用分离株的纯度和遗传稳定性，采用了严格的分离和维持方案。每种菌株均通过划线平板法纯化得到单克隆菌落，并使用通用引物（27F和1492R）通过16S rRNA基因测序确认其分类学身份（Lane等人，1985年）
筛选中的一氧化氮产生测试（步骤1：从931种菌株中选出196种）
为了评估分离菌株的免疫刺激潜力，在益生菌处理后测量了RAW 264.7巨噬细胞中的一氧化氮（NO）产生情况。NO是活化巨噬细胞中的关键效应分子，对细菌防御和先天免疫起着关键作用（Choi等人，2022年；Yang等人，2019年）。由于NO的分泌是巨噬细胞激活的标志，并且与免疫刺激细胞因子密切相关，我们将其作为主要指标
讨论
本研究通过涉及体外功能测定、安全性评估和体内疗效测试的多步骤筛选过程，鉴定并验证了具有免疫保护特性的新型益生菌菌株。从最初的931种食品和粪便来源的益生菌中，根据NO清除活性筛选出了196种。然后通过加工稳定性、胃肠道存活能力和免疫刺激能力进一步缩小范围，最终确认这些菌株是安全的
结论
总之，本研究确定了L. paracasei OS1213（KCTC 15871BP）和L. casei OS1423（KCTC 15872BP）这两种益生菌菌株是缓解CP诱导的免疫抑制的有效候选者，其中OS1423表现出特别优异的潜力。这些菌株通过多种机制恢复全身免疫功能，包括通过激活巨噬细胞增强先天免疫反应、保护肠道屏障以及增强T和B淋巴细胞反应。
CRediT作者贡献声明
金成旭（Seung Wook Kim）：撰写——审稿与编辑、验证、监督、项目管理。李朱勋（Ju-Hoon Lee）：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、监督、项目管理、资金获取、概念构思。姜友京（Yoo-Kyung Kang）：撰写——初稿、可视化、验证、资源准备、方法学、数据分析、概念构思。金友泰（You-Tae Kim）：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、可视化、验证、调查、数据分析
未引用参考文献
Rychen等人，2018年；联合国粮食及农业组织与世界卫生组织，2002年；Lin等人，2023年；Rocha-Ramírez等人，2020年；美国食品药品监督管理局，2024年。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响本文报告的工作。
数据可用性
数据可根据请求提供。
资助
本研究得到了OTOKI公司的支持，以及由韩国政府（MSIT）资助的国家研究基金会（NRF）的Bio&Medical Technology Development项目的支持（项目编号RS-2022-NR067505），并获得了食品和药品安全部（MFDS）在2025年的[22193MFDS538]拨款。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响本文报告的工作。
