蜂蜜被广泛认为是一种健康食品。这种天然甜味剂是由蜜蜂采集植物花蜜并经过适当处理制成的。因此，产蜜植物的化学成分对蜂蜜的成分和质量起着关键作用（Hungerford等人，2019年）。当蜜蜂采集含有有毒植物次生代谢物的花蜜或花粉时，人类摄入后会出现中毒症状，这类蜂蜜被视为受污染的蜂蜜（Wang等人，2023年；Xiao等人，2024年）。然而，其中一些有毒物质在低剂量下也被用作传统药物。因此，在本研究中，这些物质统称为“潜在”有害植物次生代谢物（HPSMs）。生物碱是产蜜植物中主要存在的潜在有害物质。生物碱（一类含氮的植物次生代谢物）在自然界中普遍存在（Yang等人，2024年）。蜂蜜样本中还存在一些非生物碱但有毒的植物次生代谢物，例如来自Tripterygium wilfordii Hook. F.的tribtolide，摄入后可能导致严重中毒甚至死亡（Zhang等人，2016年）。大多数潜在有害物质对蜜蜂无害；这些有毒植物仍为蜜蜂提供花蜜和花粉（Xiao等人，2024年）。然而，含有这些天然物质的蜂蜜产品对食品安全和人类健康构成潜在风险。
目前，已报道的蜂蜜产品中的主要植物来源生物碱包括吡咯里西啶生物碱、灰莲花毒素及其衍生物、Tripterygium wifordii及其衍生物、莨菪碱和gelsedine型生物碱。吡咯里西啶生物碱及其N-氧化物已在约6000种植物中被发现，主要来自千里光科（Senecio）、紫草科（Echium）、蝶形花科（Crotalaria）和菊科（Eupatorium）；其中大多数具有肝毒性（Brugnerotto等人，2021年；Lu等人，2024年）。根据德国联邦卫生局的规定，吡咯里西啶生物碱的摄入阈值分别为每天1.0 μg（连续六周）和每天0.1 μg（更长时间）（Yan等人，2022年）。蜂蜜产品常常受到高浓度吡咯里西啶生物碱的污染。例如，欧洲国家94%的零售样品和66%的原始蜂蜜样品中含有吡咯里西啶生物碱（1–267 μg/kg）（Yan等人，2022年）。在这些吡咯里西啶生物碱中，echimidine、lycopsamine和senecionine在蜂蜜产品中较为常见（Brugnerotto等人，2021年）。Tripterygium wifordii及其衍生物如tribtolide、wilforgine和wilforine来源于中国西南部的Tripterygium wilfordii Hook. F.和Macleaya cordata（Sun等人，2019年；Xiao等人，2024年）。摄入后最常见的症状包括恶心、呕吐、腹痛和腹泻（Zhang等人，2017年）。此外，健康人在摄入约50克受污染的蜂蜜后也会出现初期中毒症状（Zhang等人，2017年）。Gelsedine型生物碱来源于Gelsemium属植物，分布于北美、中国和南亚（Yang等人，2020年）。Gelsemine和gelsenicine是蜂蜜产品中最令人担忧的gelsedine型生物碱，可引起抽搐、震颤和呼吸困难等临床症状（Pedroni, Dorne, Dall'Asta, & Dellafiora, 2023年）。例如，在中国南部，食用含有gelsedine型生物碱的蜂蜜导致109人中有19人死亡（Kulawik等人，2025年）。莨菪碱通常存在于茄科（Solanaceae）和桑科（Moraceae）植物中（Romera-Torres等人，2020年）。莨菪碱可抑制毒蕈碱乙酰胆碱受体，产生毒性作用。欧洲食品安全局为阿托品和东莨菪碱的总量制定了急性参考剂量为0.016 μg/kg体重（Romera-Torres等人，2020年）。灰莲花毒素主要存在于黑海地区的Rhododendron植物中（Jansen等人，2012年；Koca & Koca，2007年）。根据灰莲花毒素的浓度，Rhododendron蜂蜜可能具有药用特性或毒性作用。其中毒症状包括头晕、恶心和感觉异常，甚至可能危及生命（Koca等人，2007年；Lucatello等人，2022年）。由于其药用特性，人们容易无意中过量摄入，从而导致中毒。灰莲花毒素I和II是蜂蜜中常见的有毒异构体（Jansen等人，2012年）。尽管少数这类物质不属于生物碱，但它们仍然是蜂蜜中常见的有害植物次生代谢物，对健康构成重大威胁。其他来自产蜜植物的HPSMs列于表S1中。含有这些HPSMs的蜂蜜可能对人类健康造成潜在危害（Moreira等人，2020年）。以往的研究主要集中在分析蜂蜜中单一或少数特定类别HPSMs的方法上，同时检测多种类型的方法较为有限。因此，开发一种准确的同时检测这些物质的技术至关重要。
传统的有机溶剂提取方法（如液-液提取LLE、固相提取SPE和QuEChERS）常用于蜂蜜样本中生物碱的提取。溶剂提取和SPE通常使用甲醇和乙腈（Brugnerotto等人，2025年）。一种改进的QuEChERS方法使用适量的乙腈提取蜂蜜中的tribtolide和protopine（Sun等人，2019年）。这些提取方法会消耗大量有机溶剂，不符合绿色化学的要求。因此，用环保、无毒或低毒性的溶剂替代有害溶剂已成为研究重点（Espino, de los ángeles Fernández, Gomez, & Silva, 2016）。
天然深共晶溶剂（NADESs）的发现和应用极大地推动了绿色化学的发展。氢键供体（HBDs）和氢键受体（HBAs）通过氢键和范德华相互作用结合形成NADESs。NADESs由天然物质合成，可作为可再生、生物基、可生物降解、低毒性的溶剂（Funari等人，2023年），具有制备简单和成本低廉的优点（El Achkar等人，2021年；Kumar等人，2023年）。通过特定任务设计，NADESs可以具备理想的性质，如pH值、极性、粘度和高溶解能力。NADESs已用于提取多种生物活性物质，如黄酮类（Oomen等人，2020年；Tzani等人，2022年）和花青素（Funari等人，2019年）。与传统的有机溶剂提取方法相比，NADESs在提取生物碱方面表现出更高的效率，并能保留其生物活性（Sitthisak等人，2024年）。含有氯化胆碱、柠檬酸和水的NADESs在提取极性和非极性生物碱方面具有多种优势。结合微波辅助提取，整个过程可减少化学废物、时间和能源消耗（Sitthisak等人，2024年）。先前的研究表明，proline-oxalic酸从Peumus boldus叶片中提取boldine的效果是甲醇的八倍（Torres-Vega等人，2020年）。NADESs的制备过程中使用的HBD类型会影响boldine的提取产量（Torres-Vega等人，2020年）。
目前，NADESs主要用于从不同天然产品中提取单一类型的特征生物碱（Jiang等人，2019年；Singh等人，2025年）。尚未有报道使用NADES技术同时提取蜂蜜中的生物碱和其他HPSMs。在本研究中，设计了一种合适的NADES以同时提取多种HPSMs，以便进行高通量分析。由于不同NADES组合的独特溶解能力，这些植物次生代谢物（生物碱和非生物碱）的提取效率存在显著差异。确定具有高提取效率的适当NADES/HBA组合是一项挑战。计算工具如COSMO-RSs模型已被用于预测溶解特定目标的有效组合（Benvenutti等人，2020年）。
在本研究中，我们尝试开发了一种基于NADES提取结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的综合分析技术，用于检测蜂蜜中的潜在HPSMs。首先，我们开发了一种LC-MS/MS方法来分析蜂蜜中的多种常见HPSMs。然后使用COSMO-RS理论筛选潜在的NADES组合，以同时从蜂蜜中提取这些物质，并通过验证实验确定最佳NADES组合。接着通过一系列单因素实验优化了NADES提取条件。最后，考虑到基质效应，进一步改进了该方法的定量过程并评估了其性能。蜂蜜中的这些HPSMs可能对消费者构成潜在健康风险，这是一个被忽视的安全问题。我们的目标是开发一种绿色、简单、高灵敏度的多组分分析方法，以检测蜂蜜中的有害植物来源物质，确保蜂蜜的安全食用。
