《Food Chemistry》：Magnetic controlled label-free homogeneous electrochemical biosensing of aflatoxin B1 based on Nanochannel-gated signal amplification strategy
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基于纳米通道和铁磁流体的磁控制无标记生物反应器开发，实现黄曲霉毒素B1（AFB1）检测过程分离与多重信号放大，检测限4×10-6 pg/mL，线性范围10-5-102 pg/mL。
张静宇|马俊平|赵碧军|康泽洲|刘晓莉|王一哲|周远振|余莎|文少华|郑建斌|白武双
西北大学食品科学与技术学院，中国西安710069
摘要
快速且高灵敏度地检测微量黄曲霉毒素B1（AFB1）对食品安全至关重要。在这项研究中，首次基于纳米通道和磁流体开发了一种新型的磁控无标记纳米通道间隔生物反应器，并实现了多重信号放大。一方面，这种设计将AFB1的识别和检测过程物理分离在一个检测系统中，有效减少了来自复杂食品样本的干扰，同时提高了检测效率。另一方面，该纳米通道间隔生物反应器结合了外切核酸酶III辅助的目标回收和杂交链反应（HCR）信号放大技术，显著提高了检测灵敏度。该方法实现了10?5至102?pg/mL的宽线性范围，检测限低至4?×?10?6?pg/mL，并具有优异的选择性和抗干扰性能。这项研究为在复杂食品样本中高灵敏度、高效地检测微量目标物质提供了一种有前景的方法。
引言
黄曲霉毒素B1（AFB1）是一种常见的致癌物，对食品安全和人类健康构成严重威胁（Li等人，2025年；Wei等人，2025年）。因此，快速灵敏地检测AFB1具有重要意义。在各种霉菌毒素检测方法中，电化学传感技术因其操作简便、灵敏度高、响应迅速和选择性优异而成为关键的分析方法（Yang等人，2024年）。传统的电化学传感器通常通过共价键合或物理吸附策略将生物识别探针固定在电极表面（Sun等人，2019年；Yang等人，2024年）。这种方法开发出了高性能传感器；例如，纳米结构复合材料在药物监测中表现出优异的灵敏度和稳定性（Dadmehr等人，2024年），而基于量子点的光学生物传感器则利用独特的光物理特性进行便携式毒素检测（Rahmanian等人，2022年）。尽管这些探针固定技术实现了电极的功能化，并促进了生物传感器的显著进展，但仍存在一些局限性。具体来说，固定过程由于固液界面的空间阻碍，常常限制了探针的空间构象，可能改变其功能结构并降低其对目标分子的结合效率和灵敏度（Chang等人，2019年；Hou等人，2018年）。此外，控制探针密度具有挑战性，且传感界面的整体构建耗时费力且成本高昂。因此，开发无固定化的生物传感策略已成为下一代电化学传感器发展的关键前沿。
均相电化学生物传感技术消除了探针固定的需求，使所有分子相互作用在均相溶液中进行。这种方法有效克服了由于界面空间阻碍导致的生物识别效率低的问题，以及传统程序的复杂性和时间消耗，提供了操作简化、响应迅速以及选择性 và 灵敏度提高等显著优势（Ma等人，2024年；Wen等人，2023年；Zhang等人，2024年）。因此，均相电化学传感在高效识别和检测微量有害物质或疾病生物标志物方面显示出显著优势。在先进的均相策略中，采用杂交链反应（HCR）放大的方法——如通过酶催化沉淀或电活性标记实现高灵敏度的HCR耦合电化学平台（Hosseini等人，2025年）——受到了广泛关注。尽管取得了显著进展，均相电化学传感策略仍面临一些技术挑战。主要限制在于对核酸探针的电活性标记的广泛依赖，这涉及昂贵和复杂的程序。这些标记要求阻碍了均相电化学传感器的开发和更广泛应用（Pengcheng等人，2023年；Shaked等人，2023年）。此外，迄今为止开发的大多数均相电化学传感方法将目标识别、信号放大和电化学信号输出集成在一个反应系统中（Sun等人，2023年；Wu等人，2023年）。然而，实际样品（如食品和血液）的复杂组成通常包含多种干扰分子。当目标识别、信号放大和电化学信号输出集成到一个反应系统中时，这些基质成分可能导致严重的背景干扰，并增加假阳性信号的可能性，特别是在检测低丰度分析物时（Jin等人，2023年；Li等人，2022年；Yang等人，2023年）。因此，通过允许每个反应在独立的反应室中独立进行，将电化学信号放大和输出与复杂的目标识别过程分离，可以有效减少背景干扰并提高分析准确性。
纳米通道间隔生物反应器是一个创新平台，由两个通过可定制的隔膜连接的独立反应室组成（O'Brien等人，2024年；Windle等人，2019年），使得化学反应在空间上分离进行而不会相互干扰（Omata等人，2025年）。隔膜不仅起到物理屏障的作用，还具有明确的孔结构和可调的传输特性，允许分子在反应室之间选择性地扩散（Habibzadeh等人，2023年；Qing等人，2020年）。因此，该反应器为受控反应过程提供了精确调控的环境。阳极氧化铝（AAO）膜作为一种高性能纳米多孔材料，以其高度有序的孔结构、均匀的孔径和规则排列的通道而著称。其三维、高密度、相互连接的纳米多孔结构赋予了优异的机械强度和化学稳定性，确保在多种操作条件下的结构完整性（Ku等人，2023年；Mijangos等人，2015年）。由于孔径通常在20至200?nm之间，具有精确控制的纳米限制效应，AAO膜具有优异的分子选择性和尺寸排除能力，能够根据分子尺寸有效调节质量传输。例如，Chen等人（Chen等人，2024年）开发了DNA超三明治改性的AAO纳米通道，将荧光检测与基于离子传输的电化学传感集成在一起，实现了对非电活性分泌分子的灵敏和准确量化。值得注意的是，他们的刺激响应纳米通道门控机制实现了双室系统中细胞间通信的实时监测，其中通道的逐步打开促进了相邻细胞群体在分泌刺激下的电化学连接。同样，Chen等人（Chen等人，2024年）使用AAO膜分隔的双室系统展示了目标响应的纳米孔门控策略，用于光电化学（PEC）生物传感。在这种方法中，三明治免疫复合物的形成和AAO纳米通道内的空间限制酶介导的生物催化沉淀（BCP）动态调节了AAO纳米通道之间的抗坏血酸扩散，直接影响了ZnInS纳米片光电极的光电流输出，从而实现了目标分析物的精确量化。此外，为了确保检测方法的特异性，选择合适的识别单元非常重要。近年来，作为霉菌毒素检测方法中最常用的识别单元之一，适配体对目标表现出优异的亲和力（Hou等人，2015年；Li等人，2017年）。因此，我们的研究中使用了适配体来识别AFB1。
在这项研究中，首次基于AAO纳米通道和磁流体开发了一种新型的磁控无标记适配体纳米通道间隔生物反应器，并实现了多重信号放大。一方面，这种设计将目标识别和检测过程物理分离在一个分析系统中，有效减少了来自复杂样本中其他物质的干扰。另一方面，该生物反应器结合了外切核酸酶III辅助的目标回收放大和杂交链反应（HCR）进行信号增强，显著提高了检测灵敏度。这项研究提出了一种通用的磁控无标记均相电化学生物传感策略，为在复杂样本中高灵敏度、高效地检测微量目标物质提供了一种有前景且可靠的方法。此外，这项技术在未来应用中具有广阔的前景：1. 提高分析技术的分离效果：通过利用纳米通道的空间限制效应，该平台可以与色谱法和质谱法等分析方法集成，实现目标分析物的有效分离（Ghani等人，2021年）；2. 多目标无标记检测：纳米通道的有序孔结构和高表面积允许在通道内固定识别元件（如适配体、抗体），实现更广泛目标的无标记检测（Chen等人，2025年；Li等人，2026年）；3. 生物模拟传输和功能设备：通过纳米通道控制的质量传输可以模拟生物功能（Wang等人，2025年），为开发离子泵、选择性分离膜和能量收集系统提供了潜力。
试剂和材料
四（4-羧基苯基）卟啉（TCPP，97%）和HAuCl4•4H2O购自上海Aladdin生化科技有限公司。4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙烷磺酸（HEPES）和亚甲蓝（MB）购自Sigma-Aldrich有限公司（上海，中国）。聚乙烯吡咯烷酮（PVP，K30，Mw?=?40,000?g/mol）由上海Yuanye生物科技有限公司提供。孔径为160–200?nm的AAO膜购自Puyuan Nano（安徽，中国）。所有
结果与讨论
如图1所示，检测系统由两个定制的半电池组成，中间夹着一块阳极氧化铝（AAO）膜，形成了一个“纳米通道间隔”生物反应器（图1A显示了传感原理的示意图，图1B展示了详细机制，图S2展示了实际设备设置和过程模拟）。所提出的均相磁控生物传感策略包括三个主要组成部分：
结论
总之，本研究首次基于阳极氧化铝纳米通道和磁流体开发了一种新型的磁控、无标记的适配体纳米通道间隔生物反应器，并实现了多重信号放大。一方面，这种设计将AFB1的识别和检测过程物理分离在一个检测系统中，有效减少了来自样本中其他物质的干扰。另一方面，纳米通道间隔
CRediT作者贡献声明
张静宇：撰写——原始草稿，软件，方法学，正式分析，数据管理。马俊平：撰写——审稿与编辑，撰写——原始草稿，软件，方法学，研究，正式分析，数据管理。赵碧军：软件，方法学，正式分析。康泽洲：软件，方法学，数据管理。刘晓莉：研究，正式分析，数据管理。王一哲：方法学，研究。周远振：监督，项目管理。余莎：
未引用的参考文献
Chen等人，2021年
Kong等人，2023年
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
我们衷心感谢国家自然科学基金（22504109）、陕西省自然科学基金（2024JC-YBQN-0156）和陕西省重点研发项目（2024NC-XCZX-54，2024CY-JJQ-39）的财政支持。我们还要感谢陕西省自然科学基金（2024JC-YBQN-0156）和咸阳市重点研发项目（S2023-ZDYF-SF-2188）的支持。
