利用基于主客体化学的离子迁移率质谱法区分支链脂肪酸的位置异构体

《Food Chemistry》：Differentiation of positional isomers of branched-chain fatty acids using ion mobility-mass spectrometry based on host-guest chemistry

采用离子迁移-质谱联用技术（IM-MS）通过冠醚（B-12C4/18C6）与金属离子（Co2?/Ca2?）形成选择性复合物，实现支链脂肪酸异构体的高效分离与定量分析。实验验证了2/4-MA和2/4-EA异构体在复合体系中的迁移差异，结合量子化学计算揭示了分子间作用力差异是分离的关键机制，并成功应用于山羊奶和果汁中痕量异构体的检测。

　　

吴乃生|何思思|丁慧琪|吴芳玲|肖宇|丁莉|丁传凡

浙江宁波大学第一附属医院新生儿科，中国浙江省宁波市海曙区留丁街59号，315010

摘要

本研究提出了一种基于离子迁移谱-质谱（IM-MS）的快速、无需衍生化的方法，用于区分食品中的短链支链脂肪酸（BCFA）的位异构体。该技术的核心策略是使目标异构体与冠醚（B12C4或18C6）在金属离子（Co²⁺或Ca²⁺）的作用下选择性地形成主客体复合物，从而放大结构差异以实现有效的迁移分离。实验结果表明，使用B-12C4/Co²⁺体系时，甲基辛酸异构体的峰对分辨率（R_p-p）达到0.622；使用18C6/Ca²⁺体系时，乙基辛酸异构体的峰对分辨率为0.560。量子化学计算和可视化分析表明，分子间作用位点和力的差异导致复合物的空间构型不同，这是实现高分辨率分离的根本机制。此外，建立的定量方法表现出优异的线性（R² > 0.99），并成功应用于山羊奶和果汁中微量BCFA异构体的分析，证实了其在食品风味分析中的实际应用价值。

引言

支链脂肪酸（BCFA）是一类含有甲基支链的生物活性脂质，在人类健康领域受到越来越多的关注（Yang等人，2025年）。BCFA的碳原子数可以是偶数或奇数，最常见的类型是饱和单甲基BCFA。某些BCFA具有挥发性，对食品风味有显著影响，尤其是在羊肉和乳制品中产生的独特“羊肉香气”（Taormina等人，2020年）。其中，4-甲基辛酸（4-MA）的气味强度远高于其碳链异构体（如2-甲基辛酸（2-MA）（Chen等人，2012年）。风味是影响消费者接受度的关键感官属性之一，因此准确识别和定量BCFA异构体对于控制羊肉及相关乳制品的风味至关重要。然而，由于BCFA异构体之间的结构相似性较高，其分析鉴定仍面临挑战。

随着仪器技术的进步，研究人员开发出了识别和表征2-/4-烷基BCFA异构体的方法，从而能够分析并阐明其结构变化，并更深入地了解其化学本质。用于识别BCFA异构体的方法包括气相色谱-质谱（GC–MS）（He等人，2018年）、气相红外光谱（Stefanov等人，2013年）、毛细管电泳-质谱（Wu等人，2014年）、超高效液相色谱-质谱（UHPLC–MS）（Yang等人，2024年）和核磁共振光谱（Markai等人，2002年）。尽管这些方法具有一定的分离能力，但化学衍生化的需求、较长的分离时间、复杂的样品制备过程以及较低的灵敏度限制了它们的广泛应用。

传统方法采用GC–MS来分离和定量复杂生物样本中的BCFA。为了便于GC–MS分析，脂肪酸通常被衍生化为甲基酯（FAMEs）以提高其挥发性（Tintrop等人，2023年）。然而，这会导致BCFA甲基酯与其他FAMEs频繁共洗脱，即使使用长而极性高的毛细管柱也是如此。虽然结合LC-串联质谱与电荷转换化学（Randolph等人，2022年）或硝基自由基引导解离（Jian等人，2022年）的策略在识别支链位置甚至磷脂结构方面表现出强大能力，但这些方法通常依赖于复杂的多阶段质谱工作流程或特定的衍生化反应，并需要较长的色谱分离时间。

相比之下，质谱（MS）是一种高度通用的分析技术，其高特异性、灵敏度和低样品消耗量使其在多个领域得到广泛应用（Awad等人，2015年）。然而，由于异构体的质量电荷比（m/z）相同，直接使用MS进行分析仍然具有挑战性（Veillon等人，2017年）。鉴于BCFA异构体之间的结构差异，我们假设离子迁移谱（IMS）可以作为一种有效的识别技术（Hill Jr.等人，1990年）。自20世纪60年代末开发以来，IMS已成为一种能够基于离子的碰撞截面（CCS）值和迁移率（K?）快速检测和识别离子的强大工具。将IMS与MS结合（IM-MS）利用了这两种技术的优势。这种集成方法的优势在于：扩展了峰容量、加快了分析速度、降低了光谱复杂性、提供了确认化合物身份的正交维度，并有可能省略色谱分离步骤（Cai等人，2024年）。

近年来，IM-MS已被用于复杂混合物的分析，并显示出在毫秒时间尺度上分离异构体的潜力。然而，由于当前IM-MS的分辨率有限，对于结构差异很小的分子实现基线分离仍然具有挑战性。为了解决这一限制，先前的研究表明，异构体与手性分子（如环糊精、大环化合物或冠醚）之间的相互作用提供了一种有效策略（Wu等人，2020年；Wu等人，2022年；Wu等人，2023年）。这些相互作用可以将结构略有不同的手性对映体转化为结构差异较大的非对映体复合物，从而实现无需色谱分离或化学衍生化的基线分离。

冠醚最初由C.J. Pedersen发现，是一种含有多个环氧乙烷重复单元的大环聚醚（Pedersen，1988年）。18-冠-6（18C6）和苯并-12-冠-4醚（B12C4）是最常用的冠醚（图S1a，b）。作为大环主体，冠醚具有环状腔体和高度电负性的杂原子，能够与金属离子和有机阳离子形成复合物（Li等人，2017年）。除了在识别金属离子和初级铵离子方面的作用外，冠醚作为分离科学中的固定相也具有重要的研究价值。由于其独特的腔体结构和离子选择性，它们被广泛用作主体化合物（Du等人，2018年；Han等人，2014年）。冠醚与分子之间的主客体相互作用代表了分子识别和分离应用中的一个基本类型。

在本研究中，使用IM-MS分析了两组BCFA异构体：2/4-MA和2-/4-乙基辛酸（2/4-EA）（图S2）。简单混合MA/EA异构体、金属离子、18C6和B12C4后，直接进行IM-MS分析。系统研究了2/4-MA/EA异构体形成的二元和三元复合物的迁移率差异，并评估了其识别效果。为了进一步解释离子迁移分离结果，我们通过密度泛函理论（DFT）计算和可视化分析（Kryachko & Ludena，2014年；Lu & Chen，2012年）对复合物进行了系统的结构分析和鉴定。此外，还对BCFA进行了定量和回收实验以验证方法的可靠性。最后，将建立的方法应用于实际的山羊奶样本分析，为食品系统中这类脂肪酸的成分分析提供了一种新策略。

实验试剂

2-MA（98%，MW：158.24）、4-MA（98%，MW：158.24）、4-EA（98%，MW：172.26）、2-EA（98%，MW：172.26）、癸酸（FA 10:0，98%，MW：172.26）、壬酸（FA 9:0，98%，MW：158.24）和B12C4（99%，MW：220.26）购自Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.（中国上海）。十七酸（HDA，98%，MW：270.45）由Energy Chemical（中国上海）提供。18C6（99%，MW：264.32）购自Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.（中国上海）。所有无机试剂均来自上述公司。

通过TIMS-MS分析的MA和EA异构体

2-/4-MA和2-/4-EA是易于在MS中脱质子的脂肪酸化合物。因此，本研究采用负离子模式进行检测。如图1左侧面板所示，这些分子形成了稳定的脱质子离子，分别为[MA-H]^?和[EA-H]^?，其m/z分别为157.14和171.16。尽管不同分支位置的异构体（如2-MA与4-MA以及2-EA与4-EA）在常规MS中显示出相同的分子离子峰，但无法通过MS区分

结论

本研究通过向2/4-MA和EA中添加B-12C4/18C6及配体（单价金属离子：Li⁺、Na⁺、K⁺、Rb⁺、Cs⁺；二价金属离子：Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺、Ni²⁺、Co²⁺、Zn²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺）来形成二元或三元复合物，从而识别了支链脂肪酸异构体。TIMS-MS结果显示，虽然2/4-MA和EA异构体都能与B12C4或18C6相互作用，但只有EA能与18C6形成复合物。然而，所得复合物的结构差异很小

CRediT作者贡献声明

吴乃生：撰写——原始稿件、方法学设计、数据分析、概念构建。何思思：验证、软件开发、实验研究、数据分析、概念构建。丁慧琪：数据可视化、实验监督、数据分析、概念构建。吴芳玲：撰写——审稿与编辑、撰写——原始稿件、数据可视化、验证、实验监督、软件应用、资源协调、项目管理、方法学设计、资金获取、数据分析、概念构建。肖宇：撰写——

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了宁波市自然科学基金（2023J378）、国家自然科学基金国际合作与交流项目（W2512055）以及国家重点研发计划（2024YFF0725800）的支持