《Food Chemistry》：Monoclonal antibody production based on different chelators and development of time-resolved fluorescent microsphere lateral flow immunoassays for lead detection
编辑推荐：
基于两种螯合剂开发的双抗体时间分辨荧光微球侧流免疫层析法灵敏度高（qLOD 0.24 and 0.09 ng/mL），与GFAAS检测结果高度一致，可快速现场筛查铅残留。分子对接揭示了抗体与铅螯合物特异性结合机制。
周梦欣|陈浩杰|黄俊俊|聂颖香|秦乐宏|潘卓辉|肖志立
中国华南农业大学食品科学学院，广东省食品质量安全重点实验室，广州市天河区五山路510642
摘要
农产品和食品中的铅污染日益严重，对人类健康造成了影响。为了有效检测食品中的铅残留，本研究利用两种螯合剂制备了两种抗体，开发了时间分辨荧光微球侧向流动免疫分析法（TRFMs-LFIAs）。这两种TRFMs-LFIAs的定量检测限（qLOD）分别为0.24 ng/mL和0.09 ng/mL，视觉检测限（vLOD）分别为20 ng/mL和10 ng/mL。实验结果表明，这些方法与12种测试金属离子无显著交叉反应。在实际样品中，TRFMs-LFIAs与石墨炉原子吸收光谱法（GFAAS）在检测Pb2+方面表现出良好的一致性，能够满足现场快速、特异性检测Pb2+的需求。此外，通过分子对接技术研究了抗体与铅螯合物之间的主要相互作用力及关键氨基酸。本研究为重金属免疫检测方法的开发与理解做出了贡献。
引言
铅（Pb）作为一种重金属，在多个行业中具有广泛应用。由于其固有的毒性和不可降解性，铅对人体健康构成严重威胁（Hao等人，2025年）。多项研究表明，体内铅的存在会增加患多种疾病的风险，如肾功能受损、甲状腺功能障碍和早产（Metryka等人，2018年）。铅暴露会对人体多个系统和器官产生不同程度的影响（Fu & Xi，2020年）。世界卫生组织报告指出，每年约有60万儿童因铅暴露而出现智力障碍（Yu等人，2022年）。各国已规定了各类食品中铅的残留限量。在中国，谷物中铅的最大残留限量（MRL）为0.2 mg/kg（GB2762–2022）。欧盟通过法规（EU）2023/915统一规定了食品中铅的残留限量，其中谷物、豆类及豆科蔬菜中的铅限量为0.2 mg/kg。美国食品药品监督管理局（FDA）在2025年发布的指导文件中规定，谷物、肉制品混合物和酸奶等食品中的铅限量为0.1 mg/kg。因此，亟需开发高灵敏度、快速检测Pb2+的技术。传统的Pb2+检测方法主要依赖于仪器分析技术，如原子吸收光谱法（AAS）、X射线荧光光谱法和电感耦合等离子体-原子发射光谱法（ICP-AES）等（De Oliveira等人，2017年；Li、Hou等人，2021年；Meira等人，2018年）。尽管这些方法具有灵敏度和准确性的优势，但需要昂贵的仪器、较长的检测时间以及专业操作人员（Singh等人，2024年；Xiao等人，2018年），无法满足大规模快速现场检测的需求。免疫检测技术基于抗原与抗体之间的特异性识别，具有高灵敏度、短检测时间和操作简便等优点，已被广泛应用于重金属检测（Xing等人，2020年；Xu等人，2020年；Tian等人，2023年）。高特异性的抗体是免疫检测方法开发的关键。铅的分子量为207.2 g/mol，不具备免疫原性，其结构特征为缺乏芳香环和带电极性区域（Zhu等人，2007年），因此需要依赖外源载体或配体基团形成抗原表位（Yu等人，2014年）。双功能螯合剂因其既能螯合金属离子又能与载体蛋白结合形成人工抗原、激发免疫反应而最为常用（Wang等人，2020年；Zhu等人，2019年）。过去常使用二乙撑三胺五乙酸（DTPA）制备重金属抗体，但其性能有待改进（Xiang等人，2010年；Yu等人，2014年）。相比之下，使用异硫氰基苯乙烯二胺四乙酸（ITCBE）制备的金属离子抗体性能更优，因此被广泛采用（Xiao等人，2018年；Xing等人，2020年；Xu等人，2020年）。研究表明，金属离子与大环配体形成的复合物在热力学和动力学稳定性上优于非环状配体（Wang等人，2020年）。此外，大环螯合剂在制备重金属抗体方面具有明显优势，可提高抗体的特异性和稳定性（Zhu等人，2019年）。侧向流动免疫分析法（LFIAs）因灵敏度高、操作简便、检测速度快而成为成熟的实时检测技术（Pedreira-Rincón等人，2025年）。与传统的胶体金探针相比，荧光纳米材料能显著提升LFIAs的灵敏度（Wu、Sun等人，2021年），主要包括时间分辨荧光纳米材料、量子点、染料基荧光纳米材料和上转换纳米粒子（Wang等人，2020年；Chen等人，2024年；Li、Wu等人，2020年）。这些荧光材料具有较长的荧光寿命和较大的斯托克斯位移，因此在LFIAs研究中得到广泛应用（Hu等人，2017年）。免疫检测的理论基础在于抗原与抗体之间的相互识别机制（Mi等人，2019年）。目前大多数抗重金属抗体的目标为金属离子与螯合剂形成的复合物。少数抗体能够直接识别金属离子，对抗体识别机制的研究有助于从空间结构和关键识别位点角度深入理解其作用机制，为抗体结构改进、性能提升及更灵敏、更特异性的免疫检测方法开发提供指导（Liu等人，2021年；Ren等人，2022年）。
本研究选用1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸（p-NH2-Bn-NOTA）和ITCBE作为双功能螯合剂制备铅的人工抗原，通过小鼠免疫和细胞融合获得了高特异性和灵敏度的单克隆抗体。基于这两种单克隆抗体，开发了用于检测大米和小麦样品中Pb2+的快速、便捷且高灵敏度的时间分辨荧光微球侧向流动免疫分析法（TRFMs-LFIAs）。分子模拟技术用于探讨不同特异性抗体对螯合剂及铅螯合物的识别机制，为进一步研究重金属抗体和免疫检测方法提供了理论基础。
化学试剂与材料
铅（Pb）、铁（Fe）、铜（Cu）、镉（Cd）、汞（Hg）、砷（As）、银（Ag）、铬（Cr）、锌（Zn）、钙（Ca）、镁（Mg）、金（Au）、锰（Mn）等试剂购自中国北京Tan-Mo Technology公司。Freund完全佐剂和不完全佐剂、钥孔贻贝血蓝蛋白（KLH）、卵白蛋白（OVA）、牛血清白蛋白（BSA）和PEG-2000购自美国密苏里州圣路易斯的Sigma-Aldrich Trading公司。ITCBE购自Dojindo Molecular公司。人工抗原的特性分析
人工抗原的紫外吸收光谱见图S2。Pb的特征吸收峰位于约240 nm和300 nm处，而载体蛋白（BSA、OVA、KLH）的特征吸收峰位于约280 nm处。人工抗原的特征吸收峰与载体蛋白不同，峰位有明显偏移且不重叠，表明人工抗原具有独特的吸收特性。结论
本研究基于p-NH2-Bn-NOTA的闭环结构和ITCBE的开环结构制备了两种针对Pb2+的单克隆抗体。开发的两种TRFMs-LFIAs可在6分钟内定性定量检测样品中的Pb2+，其定量检测限分别为0.24 ng/mL和0.09 ng/mL。这两种方法对其他金属离子无显著交叉反应，对Pb2+具有高特异性。作者贡献声明
周梦欣：撰写初稿、方法学设计、实验实施。陈浩杰：方法验证、实验验证。黄俊俊：方法验证、实验验证。聂颖香：方法验证、实验验证。秦乐宏：方法验证。潘卓辉：方法验证。肖志立：撰写、审稿与编辑、方法验证、实验监督、资金申请。伦理声明
所有动物实验均遵循1986年《动物操作（科学程序）法》（英国）、欧盟2010/63号指令（保护用于科学研究的动物）以及美国国立卫生研究院（NIH）的《实验动物护理和使用指南》进行。实验严格遵守中国法律法规，并获得了华南农业大学实验动物伦理委员会的批准。未引用参考文献
Li等人，2021年；Li、Liang、Wang和Liu，2020年利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。致谢
感谢中国国家自然科学基金一般项目（项目编号：32272405）的资助。
