《Food Chemistry: X》：Characterization and screening of a novel octapeptide from protein hydrolysates of
Crassostrea gigas and its immunomodulatory effects on RAW264.7 cells
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本研究聚焦食品源功能肽研发，针对长牡蛎来源生物活性肽的免疫调节机制不清、缺乏明确靶点与通路解析等关键问题，研究人员通过LC-MS/MS鉴定、生物信息学筛选与化学合成，获得新型八肽SWDNFLQR。研究发现，该肽可显著增强RAW264.7细胞的增殖、吞噬功能及NO、TNF-α、IL-6的分泌。其独特的双向免疫调节作用机制得以揭示：低浓度时，主要通过激活Toll样受体和PI3K-Akt通路发挥免疫增强作用；高浓度时，则在激活TLR/PI3K-Akt轴的同时，特异性抑制NF-κB通路活化，并调控关键蛋白Fn1和Prkacb。该研究成果为开发具有抗炎和免疫调节功能的海洋来源功能性食品成分提供了重要的候选分子与理论依据。
在功能性食品研发的浪潮中，源自食物的生物活性肽因其结构可塑性好、安全性高而备受瞩目。其中，海洋生物资源，特别是贝类，是挖掘新活性肽的宝库。长牡蛎（Crassostrea gigas）富含蛋白质，其水解产物已被证实具有抗炎、抗氧化等多种生物活性。然而，当前研究大多停留在复杂的混合肽层面，哪些具体肽段在起作用、它们如何调控我们的免疫系统——这些关键问题仍如雾里看花，机制模糊不清。此外，与传统的合成免疫调节剂可能引起过度免疫激活或抑制等副作用相比，食品源肽具有抗胃蛋白酶消化、作用呈剂量依赖性且可通过规模化食品加工生产等优势，其开发潜力巨大。为了拨开迷雾，从分子层面阐明长牡蛎肽的免疫调节奥秘，并为开发精准调控免疫的功能性食品提供科学依据，一项聚焦于特定肽段鉴定与机制解析的研究应运而生。
为了回答上述问题，研究人员采用了一套系统性的“鉴定-筛选-合成-验证-探索”研究策略。关键技术方法包括：1）使用木瓜蛋白酶等四种蛋白酶水解长牡蛎蛋白，并通过细胞增殖实验筛选出活性最佳的水解用酶（木瓜蛋白酶）。2）利用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）对水解产物进行肽段序列鉴定。3）结合PeptideRanker、IIITD、ToxinPred等多个生物信息学平台，对鉴定出的肽段进行生物活性预测、免疫特性分析及毒性评估，据此筛选出高潜力的目标肽段。4）通过固相合成法化学合成高纯度（>98%）的目标肽，用于后续功能研究。5）以小鼠巨噬细胞系RAW264.7为模型，通过CCK-8、中性红吞噬、ELISA等方法，在细胞水平系统评估合成肽的免疫调节功能（增殖、吞噬、细胞因子分泌）。6）采用同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）蛋白质组学技术，结合生物信息学分析（GO、KEGG、PPI网络），深入探究活性肽调控巨噬细胞免疫反应的分子机制和信号通路。7）通过蛋白质印迹法（Western blot）对蛋白质组学预测的关键通路蛋白进行验证。
研究结果
3.1. 牡蛎肽对巨噬细胞增殖率的影响
通过比较不同蛋白酶制备的牡蛎肽对RAW264.7细胞增殖的影响，发现木瓜蛋白酶水解产物促增殖效果最显著，因此被选为后续活性肽鉴定与机制研究的来源。促细胞增殖是免疫细胞活化的前提和早期指标。
3.2. 肽段鉴定筛选与化学合成
对木瓜蛋白酶水解产物进行LC-MS/MS分析，初步获得1665个肽段。通过设立严格的三级筛选标准（包括置信度分数>300、预测活性分数>0.8、肽段长度≤10、综合免疫活性预测阳性、无毒无致敏性），最终从29个高分肽段中筛选出8个高潜力候选肽，包括SWDNFLQR、VDWCPTGF等。
3.3. 合成肽对巨噬细胞增殖率的影响
在八个合成肽中，八肽SWDNFLQR在所有测试浓度下均能持续促进巨噬细胞增殖，且在100 μg/mL浓度时刺激作用最强（增殖率达136.93%），表明其可能具有更强的免疫调节潜力。
3.4. 合成肽对巨噬细胞中性红吞噬作用的影响
SWDNFLQR同样在促进巨噬细胞吞噬功能方面表现最为突出，在所有测试浓度下均能显著增强吞噬活性，进一步支持了其作为核心候选分子进行后续深入研究的价值。
3.5. SWDNFLQR对RAW264.7细胞形态的影响
显微镜观察显示，经SWDNFLQR处理后的RAW264.7细胞体积增大，伪足增多、变长，并出现液泡，形态向激活状态转变，且变化呈浓度依赖性，这与功能增强的结果相一致。
3.6. SWDNFLQR对RAW264.7细胞免疫学指标的影响
SWDNFLQR能显著促进RAW264.7细胞分泌一氧化氮（NO）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-6（IL-6）这三种关键的免疫介质。但其诱导的细胞因子分泌水平显著低于脂多糖（LPS）阳性对照组，表明其诱导的是一种相对温和、可控的免疫激活。
3.7. 基于蛋白质组学的SWDNFLQR免疫调节机制研究
3.7.1. 差异表达蛋白概述
iTRAQ蛋白质组学分析显示，与对照组相比，SWDNFLQR低浓度（CG1）和高浓度（CG2）处理组分别引起257个和214个差异表达蛋白。LPS处理组则引起更剧烈的蛋白质表达变化（1252个），凸显了多肽调控与强刺激物作用的区别。
3.7.2. 基因本体（GO）功能注释富集分析
GO分析表明，SWDNFLQR处理后，在生物过程层面显著富集了“细胞对白介素-1的反应”、“趋化作用的正调控”等条目；在分子功能层面，则影响了蛋白酶结合、信号受体结合等，提示其通过调节免疫信号感知与传导发挥作用。值得注意的是，高浓度组还显示出对“经典NF-κB信号转导的负调控”，暗示了其潜在的抗炎机制。
3.7.3. KEGG通路富集分析
这是揭示机制的核心。分析发现，SWDNFLQR处理显著富集了Toll样受体（TLR）信号通路和PI3K-Akt信号通路。低浓度处理主要激活这两条通路。而高浓度处理在同样激活TLR和PI3K-Akt通路的同时，却显著抑制了NF-κB信号通路和TNF信号通路。这揭示了SWDNFLQR独特的双向作用模式：在激活免疫的同时，能抑制过度的炎症反应。
3.7.4. 蛋白质相互作用网络分析
蛋白质相互作用网络分析鉴定出纤维连接蛋白1（Fn1）和蛋白激酶cAMP激活催化亚基β（Prkacb）是两个关键枢纽蛋白。Fn1在细胞粘附和免疫细胞迁移中起重要作用，Prkacb是cAMP-PKA信号轴的关键组分，该通路通常参与抗炎反馈调节。
3.8. 蛋白质印迹验证
Western blot结果从蛋白水平证实了上述发现：SWDNFLQR处理能显著上调TLR4蛋白表达并增强Akt的磷酸化（p-Akt），验证了TLR4/PI3K-Akt通路的激活。更重要的是，它验证了SWDNFLQR对NF-κB的双向调控：低浓度无显著影响，而高浓度能显著下调总NF-κB及其磷酸化形式（p-NF-κB）的水平。同时，Fn1和Prkacb蛋白的上调也得到了证实。
3.9. SWDNFLQR免疫调节构效关系与作用机制分析
综合所有结果，研究提出了SWDNFLQR的作用机制模型。其氨基酸序列（Ser-Trp-Asp-Asn-Phe-Leu-Gln-Arg）中同时含有疏水性氨基酸（如Trp, Phe, Leu）和带电氨基酸（Asp, Arg），形成两亲性结构，利于与细胞膜或受体相互作用。其免疫调节作用主要通过TLR4/PI3K-Akt信号轴实现。其双向调节的奥秘在于：高剂量时，在激活TLR4/PI3K-Akt轴的同时，可能通过上调Prkacb激活cAMP-PKA信号轴，进而对下游的NF-κB通路产生特异性负反馈抑制，从而在增强免疫功能的同时避免过激炎症。
结论与意义
本研究成功从长牡蛎木瓜蛋白酶水解物中鉴定并筛选出一种新型免疫调节八肽SWDNFLQR。该肽能有效增强巨噬细胞的增殖、吞噬功能及关键免疫介质的分泌。其最突出的科学价值在于揭示了一种独特的“双向免疫调节”机制：在低浓度下，它主要通过激活Toll样受体（TLR）和PI3K-Akt信号通路发挥免疫增强作用；而在高浓度下，它在激活相同起始通路的同时，能通过调控Prkacb等关键蛋白，特异性抑制NF-κB信号通路的过度活化，从而实现免疫激活与抗炎效应的平衡。这种“既增强基础免疫，又防止炎症过冲”的特性，使得SWDNFLQR不同于单纯的免疫刺激剂（如LPS）或抗炎剂，成为一种极具潜力的、可用于调节免疫平衡的候选分子。
这项研究的意义是多方面的。在理论层面，它首次在分子和通路水平深入阐明了特定长牡蛎来源肽的免疫调节作用机制，特别是发现了其剂量依赖性的双向调节模式，为食品源活性肽的构效关系与复杂调控网络研究提供了新案例。在应用层面，SWDNFLQR作为一种源自天然食品、安全性高的短肽，为开发具有“免疫调节”或“抗炎”宣称的功能性食品、特殊医学用途配方食品或膳食补充剂提供了宝贵的候选原料和坚实的科学依据。例如，它或适用于需要温和增强免疫力、同时又需控制慢性低度炎症的人群。未来研究可围绕其结构优化、在复杂食品体系中的稳定性与生物利用度，以及体内功效验证等方面展开，推动这一海洋馈赠从实验室走向餐桌，服务于人类健康。
