《Gene Reports》：Molecular characteristics of
PcL-Lec and association analysis between its haplotypes and the potential disease resistance in red swamp crayfish (
Procambarus clarkii)
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红水蟹抗病基因PcL-Lec的克隆及SNP关联分析。通过RT-PCR克隆PcL-Lec基因并发现其与澳洲淡水龙虾 lectin蛋白序列同源性最高。利用KASP技术检测到ORF区7个SNP，其中SNP504-AA与弧菌抗性相关，SNP292-AA与白斑病抗性相关。RNA干扰证实PcL-Lec通过C型凝集素受体通路调控NF-κB、Ca2+信号及PI3K/Akt/mTOR免疫轴，为分子育种提供新标记。
张含英（Hanying Zhang）、刘甜甜（Tiantian Liu）、刘学伟（Xuewei Liu）、任欣（Xin Ren）、白旭峰（Xufeng Bai）
中国华中农业大学双水双湖研究所作物遗传改良国家重点实验室，武汉，430070
摘要 在中国，红沼螯虾（Procambarus clarkii ）产业的迅速扩张导致了疾病爆发率的增加，对可持续发展构成了严重威胁。在本研究中，我们首先通过逆转录技术克隆了编码凝集素蛋白的PcL-Lec 基因，并发现其与Cherax quadricarinatus 的氨基酸序列同源性最高。在受到Vibrio parahaemolyticus （VP）和白斑综合征病毒（WSSV）刺激时，PcL-Lec 的表达上调。通过对PcL-Lec 基因进行单核苷酸多态性（SNPs）分析，使用竞争性等位基因特异性PCR方法发现了与疾病抗性相关的单倍型。在PcL-Lec 基因中检测到7个SNPs，其中4个位点的突变导致了氨基酸的变化。其中，SNP504-AA和SNP292-AA分别与VP和WSSV的抗性相关。这些结果表明，特定的PcL-Lec SNP单倍型可以作为培育抗病螯虾的分子标记。
引言 Procambarus clarkii 属于Cambaridae科，俗称红沼螯虾或淡水螯虾。它是中国淡水养殖业中的关键物种。根据《中国螯虾产业发展报告（2024）》，2023年的养殖面积为196.7万公顷，总产量达到316.1万吨，在中国淡水养殖物种中排名第四。然而，螯虾产业的迅速扩张导致了养殖密度的增加，以及疾病发病率的上升，病毒和细菌病原体对产业发展构成了重大挑战（Jiravanichpaisal等，2009）。
许多研究已经探讨了导致螯虾疾病的病原体。白斑综合征病毒（WSSV）被认为是危害甲壳类动物的最严重的病毒病原体，其特征是发病迅速、死亡率高（Yan等，2007）。WSSV在螯虾中广泛存在，可感染包括血淋巴、肝胰腺和鳃在内的多个器官。在20–28°C的水温下，该病毒在宿主体内快速复制，在有利条件下可能导致大规模死亡（Zhang等，2018；Talukder等，2021；Chen等，2022；Gu等，2023）。相比之下，细菌性疾病在初期往往不易被发现且毒性较低，但后期可能迅速传播，对螯虾生产造成严重损害。从红沼螯虾中分离出的常见细菌包括Vibrio parahaemolyticus （VP）和Aeromonas hydrophila （Quaglio等，2006），VP感染的螯虾在养殖场中较为常见（Huo等，2022）。此外，多项研究表明，与免疫相关的基因调节了螯虾对VP和WSSV的抵抗力（Ren等，2022b；Lu等，2024；Tang等，2024）。
与其他甲壳类动物类似，螯虾缺乏成熟的T淋巴细胞和B淋巴细胞，因此无法启动适应性免疫反应。因此，它们主要依赖先天免疫系统来抵御病原体入侵（Cerenius等，2008；Li和Xiang，2013；Cerenius和S?derh?ll，2018）。病原体相关分子模式（PAMPs）与模式识别受体（PRRs）结合，触发免疫细胞识别和快速的信号转导级联反应，激活体液免疫和细胞免疫反应（Tassanakajon等，2013；Loker等，2004）。体液免疫由非特异性酶、凝集素和溶血素介导，这些成分在prophenol氧化酶系统、补体蛋白和抗菌肽中起关键作用（Müller等，2008；Xian等，2016）。最近的研究关注了Toll样受体（TLRs ）、C型凝集素（CTLs ）和脂多糖结合蛋白（LGBPsPcLectin ，其在感染多种病原体后表达上调（Zhang等，2020）。敲低PcLectin后用VP刺激可以抑制某些抗菌肽的表达，而重组PcLectin蛋白对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌均具有结合活性（Yang等，2023）。PRRs、PAMPs和损伤相关分子模式之间的相互作用会导致受体发生复杂的构象变化，激活包括NF-κB、JAK/STAT、IMD和Toll通路在内的下游免疫信号通路（Wu等，2024）。有研究表明，C型凝集素可以通过激活Penaeus japonicus中的JAK/STAT通路来诱导抗菌肽（AMPs）的表达（Sun等，2017）。在螯虾中敲低HepCL后，ALF1和ALF5抗菌蛋白的表达降低（Cao等，2021）。PcLec2已被确定为病原体激活proPO表达的免疫反应检测器（Wang等，2011）。C型凝集素蛋白CLEC3A的表达与人类骨肉瘤细胞中AKT1和mTOR的表达呈正相关（Ren等，2020）。小鼠中的C型凝集素受体Dectin-2可诱导IL-2的产生（Watanabe等，2019）。RAC参与小鼠细胞中的IL2诱导的膜皱褶和免疫调节（Arrieumerlou等，1998）。当CTL受体被激活时，常观察到ERK蛋白的磷酸化修饰（Caparros等，2006），转录因子NF-κB和JUN参与了人类胶质母细胞瘤细胞中半乳糖凝集素-3的诱导（Dumic等，2000）。CTL受体与NFATc2合作，控制小鼠树突状细胞对微生物刺激的反应（Yu等，2015）。此外，据报道CTL（EsLecH）可通过JNK通路在螃蟹（Eriocheir sinensis ）中正向调节抗菌肽的表达（Zhu等，2016）。在STS处理条件下，当敲低C型凝集素蛋白时，人类胶质瘤细胞中的CASP-3和CASP-7显著下调（Arito等，2024）。
单核苷酸多态性（SNPs）是指基因组某个位置上的碱基替换、插入或缺失。大多数SNPs是双等位的，至少在1%的群体中存在（Altshuler等，2015）。作为最普遍的基因组变异类型，SNPs产生了丰富的遗传多样性，使其适合自动化基因分型，并成为遗传研究中的主要标记类型（Brookes，1999；Budowle和Van Daal，2008）。在螯虾中，SNPs与生长和疾病抗性等表型特征之间的关联已被频繁报道（Xu等，2019；Shi等，2022）。先前的一项研究通过转录组分析鉴定出一个新的VP抗性基因（R ）和两个免疫基因（ALF 和crustin2 ）（Ren等，2022a）。这三个基因中的SNPs与疾病抗性相关，单倍型ALF1 、R1 和Cru1 被确定为分子育种的理想候选基因。随后提出了一种利用具有有利单倍型的亲本来增强疾病抗性和提高产量的育种策略（Ren等，2022b）。然而，已知的免疫基因并不能完全解释疾病抗性的表型变异。一些基因，包括PcL-Lec ，已被证明对螯虾的病原体挑战有响应（Ren等，2022a）。
在本研究中，我们从螯虾中克隆了PcL-Lec基因，并使用六个自然种群（每种病原体三个重复组，每组120–150只个体）评估了其在疾病抗性中的作用。根据挑战后的存活时间，将个体分为易感（S）、抗性（R）和强抗性（SR）。此外，使用竞争性等位基因特异性PCR（KASP）检测了PcL-Lec 开放阅读框（ORF）内的SNPs。最后，我们对六个螯虾种群（三个种群受到VP挑战，三个种群受到WSSV挑战）进行了关联分析，研究了PcL-Lec的SNPs和单倍型与其疾病抗性表型之间的关系。本研究旨在确定PcL-Lec作为疾病抗性基因，发现与疾病相关的SNPs和单倍型，并探索关键的下游调控靶点。这些发现增强了我们对螯虾免疫机制的理解，并为选育抗病螯虾提供了遗传资源。
章节片段 螯虾样本的收集 用于SNP发现的最初150个螯虾样本来自湖北省武汉市华中农业大学的水稻-螯虾养殖基地。这些样本的遗传资源来自洞庭湖、鄱阳湖、魏山湖、洪湖和洪泽湖等不同区域。
此外，用于疾病抗性关联分析的螯虾样本专门从湖北省武汉市的白沙洲市场收集。
PcL-Lec 的ORF序列及其编码蛋白的同源性分析通过逆转录PCR获得了螯虾中
PcL-Lec 基因的ORF序列，长度为510 bp，编码169个氨基酸（GenBank登录号LOC123765136，图1A）。在国家生物技术信息中心（
https://www.ncbi.nlm.nih.gov ）的数据库中进行BLAST分析表明，PcL-Lec的氨基酸序列与其他螯虾凝集素的同源性较低（25.51%–29.59%），其中与...
C型凝集素的分子特征和在免疫调节途径中的功能差异 CTLs是无脊椎动物先天免疫系统的关键组成部分，通过其碳水化合物结合域介导病原体识别、免疫信号传导和抗菌防御（Tassanakajon等，2013；Wang等，2020）。在甲壳类动物中，CTLs结合PAMPs（如脂多糖和肽聚糖），通过NF-κB和MAPK等通路启动免疫级联反应（Encinas-Garcia等，2024）。在这里，螯虾中鉴定出的PcL-Lec 基因编码一种具有保守CLECT结构的新CTL结论 成功克隆了螯虾中的PcL-Lec基因，并根据其在VP和WSSV挑战下的表达变化确定了其在疾病抗性中的作用。RNA干扰实验表明，SNP504-AA和SNP292-AA分别与VP和WSSV的抗性相关，我们据此开发了相应的KASP方法
CRediT作者贡献声明 张含英（Hanying Zhang）： 撰写初稿、进行正式分析。刘甜甜（Tiantian Liu）： 进行正式分析、数据管理。刘学伟（Xuewei Liu）： 数据管理。任欣（Xin Ren）： 数据管理。白旭峰（Xufeng Bai）： 撰写、审稿与编辑、监督、资金获取、概念构思。
未引用的参考文献 国家水产品技术推广站和中国渔业协会，2024
致谢 本项工作得到了国家重点研发计划 （2022YFD2400700）、CARS-48专项基金、湖北省种子产业高质量发展基金项目（HBZY2023B009）、中央高校基本科研经费（2662025SCPY008）以及华中农业大学高层次人才引进研究启动经费的资助。
