整合网络毒理学与蛋白质组学揭示庆大霉素所致耳毒性的关键通路

《Hearing Research》：Integrative Network Toxicology and Proteomics Identifies Key Pathways in Gentamicin-Induced Ototoxicity

庆大霉素耳毒性机制研究揭示其通过干扰HIF-1、PI3K-Akt、FoxO信号通路及自噬过程，导致内耳毛细胞结构损伤、代谢紊乱和炎症激活，形成多维度毒性网络。蛋白质组学发现泛素-蛋白酶体系统激活和补体凝血级联反应显著失调，并识别早期损伤相关蛋白作为液体活检标志物。

　　

韩润南|宁宇|林石

中国大连医科大学第一医院耳鼻喉科。

摘要

庆大霉素（GEN）是一种代表性的氨基糖苷类抗生素，在临床抗感染治疗中发挥着不可替代的作用。然而，其耳毒性是限制长期或高剂量使用的主要不良反应之一。耳毒性主要表现为内耳毛细胞的不可逆性凋亡以及听觉和前庭功能的逐渐丧失，严重影响了患者的生活质量。目前，其具体的分子机制尚未完全明了，且缺乏有效的早期预警指标和干预靶点。

本研究通过综合计算预测和动物实验验证，系统地揭示了庆大霉素诱导的耳毒性的多维分子机制。网络毒理学预测表明，庆大霉素可能通过干扰HIF-1、PI3K-Akt和FoxO等信号通路以及自噬过程来破坏内耳细胞的稳态。蛋白质组学结果进一步证实，庆大霉素损伤会导致蛋白质表达的广泛变化，包括泛素-蛋白酶体系统的激活、自噬的失调、补体系统介导的炎症反应以及与突触功能相关的蛋白质下调。这些变化共同导致了内耳毛细胞的结构损伤、代谢紊乱、免疫炎症激活和功能丧失，形成了一个复杂的毒性网络。

本研究确定的核心靶点（如Pten、Stat3）和关键通路（如补体和凝血级联、能量代谢、PI3K-Akt信号通路）为后续的功能验证提供了明确的方向。同时，差异表达的蛋白质谱，尤其是那些在损伤早期显著变化的分子，有望作为临床监测的液体活检生物标志物，实现耳毒性的早期预警。

引言

庆大霉素是一种常用的氨基糖苷类抗生素，用于治疗严重的细菌感染（Lii等人，2004年），但不幸的是，它具有显著的耳毒性副作用，这限制了其临床应用（Pender，2003年）。其主要问题之一是它能够损伤前庭毛细胞，从而导致平衡功能障碍和听力损失风险增加。使用豚鼠和猫模型的研究表明，庆大霉素优先在I型前庭毛细胞中积累，导致这种特定亚型的大量丧失，而II型细胞相对不受影响（Lyford-Pike等人，2007年）。传统的研究主要集中在与氧化应激和线粒体凋亡相关的通路，如活性氧（ROS）爆发和caspase级联反应（Akila等人，2025年），以及通过TLR4/NF-κB介导的炎症激活先天免疫反应（Ali等人，2023年）。体外研究表明，庆大霉素暴露会触发毛细胞的caspase依赖性内在凋亡，导致核碎片化和DNA损伤（Forge和Li，2000年），这可能阻碍细胞在细胞完整性丧失后的再生（Qian等人，2021年）。值得注意的是，Notch信号通路在此过程中起着关键作用；庆大霉素被发现能够上调Notch1、Jagged1和Hes1的表达，从而增加凋亡蛋白的产生。抑制剂如gastrodin通过抑制Notch通路显示出减少这种损伤的潜力（Jiang等人，2024年）。然而，其潜在机制非常复杂，并且存在显著的变异性，特别是在细胞类型特异性摄取和再生动态方面。例如，在新生小鼠中过表达Atoh1可以促进毛细胞再生，但也可能干扰毛细胞亚型的正确分化（Qian等人，2021年）。

目前该领域的局限性包括几个关键问题：首先，许多研究依赖于单剂量方案或孤立器官模型，忽略了系统蛋白质调控网络的复杂性；其次，豚鼠的前庭功能恢复（如对线性加速度的反应）非常有限，而耳蜗功能的部分恢复则更为显著（Bremer等人，2014年）；第三，缺乏专门针对庆大霉素诱导的前庭毛细胞损伤的整合分子网络分析。为了解决这些问题，我们提出了一种双重方法。该方法结合了网络毒理学来模拟庆大霉素与Notch相关蛋白之间的相互作用网络，并利用定量蛋白质组学来系统地绘制蛋白质表达和功能级联的动态图谱。尽管蛋白质组学分析在这一领域尚未得到充分应用，但它们提供了一种强大的手段，通过揭示药物特异性的蛋白质组学特征和识别关键通路来克服传统还原论方法的局限性（Skowronek和Meier，2022年）。据我们所知，这是首次将网络药理学和蛋白质组学结合起来探索与庆大霉素耳毒性相关的蛋白质组学景观和信号通路的研究，从而提供了有价值的机制见解，可能有助于发现新的治疗靶点。

章节片段

网络毒理学分析

在网络毒理学分析部分，庆大霉素（CAS 1403-66-3）的结构数据来自PubChem，用SMILES表示法表示为：C1C2C(C(C(C1N)OC3C(C(C(C(O3)CO)O)O)N)O)OC4C(C(N)C(C(C4O)O)N)O)。使用ProTox-3.0和ADMETlab3.0评估了其耳毒性潜力，同时通过TargetNet（Yao等人，2016年）、SuperPred（Dunkel等人，2008年）和Swiss Target Prediction（Daina等人，2019年）识别了靶蛋白，所有这些工具都使用了默认参数。

庆大霉素的毒性预测结果

基于全面的文献回顾和在线资源的预测，确定庆大霉素具有引起耳毒性损伤的潜力。ADMETlab 3.0网站提供的预测显示庆大霉素诱导耳毒性的概率为0.993（如图1所示），表明发生耳毒性效应的可能性非常高。该输出值的范围是从0到1，数值越接近1表示耳毒性存在的概率越高。

从网络毒理学角度探讨“缺氧-炎症-自噬”级联的多靶点验证机制

通过网络毒理学分析确定的核心靶点，如HIF1A和MTOR，与蛋白质组学分析中发现的差异表达蛋白有显著重叠，包括Atg9a和Rnf150。HIF1A是一种缺氧诱导因子，在调节关键糖酵解酶Pkm的表达中起关键作用，这与KEGG分析中确定的“代谢通路”结果一致。这共同说明了庆大霉素如何破坏能量

结论

本研究通过蛋白质组学分析探讨了庆大霉素如何损伤前庭毛细胞，结果显示“补体和凝血级联”通路在KEGG分析中最为显著富集，q值为2.3×10^-11，识别出45种富集蛋白。在该通路中，补体成分（包括C3和Cfb）以及纤维蛋白原（FGA/FGB/FGG）显著增加。该通路的激活在招募

CRediT作者声明

韩润南：研究、数据管理、初稿撰写、审稿与编辑、正式分析。

林石*：概念构思、资金获取、监督、审稿与编辑。

*通讯作者

（注：上述声明准确反映了每位作者对本研究的特定贡献，符合CRediT（贡献者角色分类）的要求，并已得到所有作者的批准。）

动物伦理声明

该动物研究获得了中国人民解放军总医院医学伦理委员会的批准，项目名称为“基于深度学习的听觉脑干诱发电位智能识别研究”，批准日期为2021年3月2日。批准编号为S2020-465-01。所有程序均按照相关指南和规定进行。

资金支持

本研究得到了辽宁省教育厅的支持（资助编号JYTMS20230575）

我们感谢美国布法罗大学的Ding教授提供的宝贵帮助。

CRediT作者贡献声明

韩润南：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、研究、正式分析。宁宇：软件、资源、方法学、研究。林石：监督、资源、方法学、研究、资金获取、正式分析、概念构思。