《International Journal of Antimicrobial Agents》：A window into resistance: the MEGA-plate as a model of evolutionary dynamics
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MEGA- plates作为新型空间实验平台，在揭示微生物抗生素耐药性进化机制中具有重要价值。其通过模拟临床抗生素梯度环境，动态观测细菌在空间迁移中的适应性变化，包括多药共选、交叉耐药（如β-内酰胺类、氟喹诺酮类）及耐药突变轨迹。研究还扩展至金属耐受真菌进化，并开发SAGE等变体提升实验效率。该平台在理解进化动力学（如克隆干扰、突变率调控）及指导临床抗生素管理方面展现独特优势，为复杂环境下的耐药性预测提供新工具。
梅瑟姆·侯赛因（Maytham Hussein）| 拉法赫·阿洛巴维（Rafah Allobawi）| 詹姆斯·巴克利（James Barclay）| 志英科（Zhi Ying Kho）| 萨姆·谢姆布里（Sam Schembri）| 图拉亚·萨法·安萨夫（Thuraya Safaa Ansaf）| 伊恩·R·蒙克（Ian R. Monk）| 拉吉尼坎特·夏尔马（Rajnikant Sharma）| 高里·G·拉奥（Gauri G. Rao）| 建立（Jian Li）| 托尼·维尔科夫（Tony Velkov）
澳大利亚维多利亚州克莱顿市莫纳什大学药理学系，莫纳什生物医学发现研究所（Monash Biomedicine Discovery Institute, Department of Pharmacology, Monash University, Clayton, VIC 3800）
摘要
“微生物进化与生长实验平台（MEGA-plate）”是一种具有空间结构的实验系统，能够直接观察微生物在抗菌压力下的适应过程。与传统混合培养模型不同，MEGA-plate能够实时捕捉空间动态和进化瓶颈，为耐药性的发展提供了独特的见解。自该平台问世以来，它已被应用于多个领域，从教育和进化理论研究到抗生素耐药性的临床相关研究。近期研究表明，该平台能够揭示突变轨迹、多重药物共选择现象以及对β-内酰胺类和氟喹诺酮类等关键药物的交叉耐药性，以及真菌病原体的耐药性机制。本文综述了这些进展，强调了其对抗菌管理、耐药性监测和治疗策略的重要意义。通过整合细菌、真菌和兽医领域的发现，我们突出了MEGA-plate作为预测耐药性途径和指导临床微生物学的工具的转化潜力。重要的是，我们将MEGA-plate与已建立的实验进化系统（如连续传代培养、连续培养和反馈控制选择装置）进行了比较，明确了在哪些情况下空间药物梯度具有独特的机制价值，以及在哪些情况下需要采用替代方法来研究难以培养的微生物和群体层面的问题。
部分内容摘要
图形摘要
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实验进化长期以来一直被用于研究微生物在压力下的适应和共选择现象。传统方法包括在批量培养中进行连续传代，其中微生物群体在混合均匀的环境中进化。虽然这种方法具有可扩展性，但可能会掩盖空间结构、瞬态异质性和许多实际环境中出现的前沿驱动竞争。连续培养系统通过维持定义明确的生长环境来克服这些局限性。MEGA-plate上的耐药性进化时空动态
MEGA-plate是由Baym等人开发的[4]，这是一个开创性的实验平台，可以实时观察细菌在具有空间结构的抗生素梯度下的进化过程[4]。最初的实验设计是一个约120×60厘米的琼脂培养基系统，其中包含逐渐增加的抗生素浓度（最高可达100,000倍最低抑菌浓度[MICs]），使像大肠杆菌（Escherichia coli）这样的运动型细菌能够在迁移过程中扩散、突变和适应。MEGA-plate的当代研究综述
Baym等人在2016年开发的MEGA-plate被认为是突破性科学成果，因为它填补了微生物进化研究中的一个关键空白[4]。与使用无空间限制的混合培养的传统进化实验不同，MEGA-plate提供了一个大规模的结构化环境，在营养琼脂培养基中施加阶梯式的抗生素梯度。Baym等人使用的120×60厘米培养板通过允许细菌运动的力量，进一步增强了实验的实用性。MEGA-plate的工作原理
为了深入理解MEGA-plate的工作原理，我们首先回顾了Kishony实验室的原始实验报告，该报告详细描述了其设计和核心发现。在这个系统中，无菌边缘接种的大肠杆菌通过趋化作用和生长逐渐占领各个区域。当抗生素浓度达到抑制野生型细胞的水平时，只有耐药突变体才能继续前进。通过数天到数周的时间延迟成像，研究人员观察到了显著的动力学变化。MEGA-plate的优势与局限性：与其他进化平台的比较
MEGA-plate应在更广泛的实验进化系统框架内进行理解，其中空间选择与混合培养和反馈控制方法相辅相成。在混合培养的连续传代过程中，虽然可以在离散时间点量化耐药性轨迹，但缺乏空间异质性和前沿驱动效应。连续培养、恒化培养和浊度控制培养可以实现受控的生长状态和长期实验，但通常仍然保持混合状态。种群规模的重要性：罕见突变体的理论
为了形式化这些空间动态，克莱因曼（Kleinman）提出了一个适用于MEGA-plate种群扩张的非稳态马尔可夫框架。克莱因曼的研究将Baym等人观察到的实证模式与进化变化的数学模型联系起来[11]。在这个框架内，可以使用马尔可夫链有效模拟细菌DNA在选择压力下的进化动态，但参数会随着种群规模的扩大而变化[11]。碳青霉烯类抗生素与副效应：铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的交叉耐药性
除了经典的耐药性决定因素外，进化环境本身也会影响耐药性的产生。Savinova等人使用改良的时空MEGA-plate平台与铜绿假单胞菌进行实验，模拟了临床感染中常见的异质性药物暴露情况[14]。他们使用参考菌株ATCC 27853，在含有逐渐增加抗生素浓度的半固态琼脂培养基中培养细菌216小时。SAGE：用于快速动力学研究的紧凑型MEGA-plate
Ghaddar、Hashemidahaj和Findlay开发了紧凑型软琼脂梯度进化（SAGE）MEGA-plate变体系统，用于研究大肠杆菌中高影响力突变的存在如何影响其对不同抗生素类别的耐药性[17]。该系统消除了对定制培养盘的需求，改用了通用抗生素梯度培养板格式。他们的研究表明...超越抗生素：细菌的金属耐受性进化
金属暴露是一种普遍存在的环境压力，可以影响细菌进化，并通过与抗菌药物的共选择和共同的压力响应途径相互作用。细菌的实验进化研究表明，长期暴露于铜、银和镉等金属会筛选出影响外排系统、膜通透性、氧化还原平衡和全局调控因子的突变，通常伴随着在无金属环境下的适应性折中。超越细菌：真菌的金属耐受性进化Wang等人将MEGA-plate应用于平菇（Pleurotus ostreatus）的适应性实验室进化实验，培育出了具有极端镉（Cd）耐受性的突变体[10]。他们使用0至480毫克/千克的镉浓度梯度，使耐镉的野生型菌株JN21在6个月内逐渐暴露于更高浓度的镉环境中[10]。从160毫克/千克及以上浓度区域筛选出了10个突变体，其中一些突变体的耐受性提高了三倍。
梯度上的抗菌肽：纳西菌素（Nisin）作为案例研究
纳西菌素是一种具有明确抗菌活性的脂肽类抗菌剂（AMP），对革兰氏阳性病原体有效，并且长期以来被安全使用，近年来在局部治疗和辅助治疗应用方面受到越来越多的关注[22]。具有空间结构的实验进化平台可以探讨在非均匀浓度梯度下暴露于AMP是否会导致与均匀暴露下不同的耐药性轨迹[2]。Costa等人利用...兽医应用与人类风险：对关键人类药物的交叉耐药性
Kerek等人改进了MEGA-plate，用于研究大肠杆菌对兽医用抗生素氟苯尼考（florfenicol）的微进化过程，同时发现了对该药物类别的共选择和交叉耐药性[8]。他们使用从1倍到1000倍MIC的逐步增加的氟苯尼考梯度，监测了大肠杆菌的生长、耐药性表型变化和基因组突变。结果表明，MIC值随剂量增加而显著上升，但这不仅限于氟苯尼考...两种通往高水平氨苄西林耐药性的途径
Gross等人利用MEGA-plate研究了大肠杆菌中的β-内酰胺类耐药性途径，区分了依赖β-内酰胺酶的耐药性和独立耐药性轨迹[5]。鉴于β-内酰胺类耐药性在临床重要病原体（如大肠杆菌）中的快速出现对感染控制构成了巨大挑战，而氨苄西林是最常用的β-内酰胺类抗生素之一，其耐药性的增加严重影响了其临床效果[25]，这项工作尤为重要。MEGA-plate作为课堂案例研究Carr等人将MEGA-plate的发现转化为教学案例研究，将进化原理融入微生物学教育[6]。他们的课程将突变、选择和快速进化等核心生物学概念与抗菌抵抗的实际应用相结合[6]。该案例研究分为四个部分。
机制重点：应激反应与SOS相关突变
抗生素暴露不仅可以通过选择已存在的突变体来影响耐药性进化，还可以通过调节细胞应激反应（如DNA修复 fidelity和突变率）来影响进化过程。在许多细菌物种中，SOS反应（通常由RecA/LexA网络调控）会诱导易出错的DNA聚合酶的表达，从而在基因毒性压力期间增加突变负担[26,27]。这种应激相关的突变...对临床微生物学和抗菌管理的转化意义
不均匀的抗生素暴露是许多感染的共同特征，这源于组织穿透性、脓肿或生物膜结构的差异以及药代动力学的变异性。因此，空间药物梯度代表了具有临床意义的选择环境，而非单纯的实验抽象[2]。MEGA-plate提供了一个可行的实验模型，可以直接观察药物压力的逐步增加如何促进逐步适应。关键考虑因素与注意事项
MEGA-plate平台不仅是一个强大的研究工具，还是理解进化原理（如克隆干扰、遗传漂变、进化救援和适应性景观）的可视化工具。该系统使抽象的群体遗传学概念变得具体化，为研究群体结构、突变供应和空间瓶颈如何影响微生物适应提供了物理模型。空间进化平台的未来发展方向
展望未来，MEGA-plate平台在更广泛的应用中具有巨大潜力。结合多药或顺序抗生素梯度可以研究在空间结构化选择条件下的进化权衡、副效应敏感性和交叉耐药性，这些在均匀暴露条件下难以研究[2,4]。引入多药梯度将使研究人员能够在复杂的选择压力下研究进化权衡...
