《MUTATION RESEARCH-GENETIC TOXICOLOGY AND ENVIRONMENTAL MUTAGENESIS》：Arsenite: toxicity and genotoxicity in a mouse Leydig cell line
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砷对TM3 Leydig细胞的毒性机制研究显示，其浓度依赖性降低细胞活力，抑制抗氧化酶活性导致氧化失衡，诱发凋亡及DNA损伤（micronucleus、comet、染色体畸变）。首次证实砷在体外具有生殖细胞遗传毒性，为男性生殖系统砷暴露危害提供机制依据。
作者：Yasemin AYDIN、Gulsah ARMUT、Iremnur SARIALIOGLU、Banu ORTA YILMAZ
所属机构：土耳其伊斯坦布尔大学理学院生物系
摘要
砷是一种常见的环境污染物，其对多种生物系统尤其是男性生殖系统具有有害影响。尽管已有多种研究和证据表明亚砷酸盐（As）暴露具有基因毒性，但针对男性生殖系统的研究仍然有限。本研究通过体外实验（in vitro assays）评估了亚砷酸盐对TM3莱迪希细胞（Leydig cells）的细胞毒性、凋亡效应和基因毒性。莱迪希细胞在睾丸功能中起着关键作用。实验中，这些细胞被暴露于逐渐增加的亚砷酸盐浓度（1、2、4和6 μM）下24小时，然后分析细胞存活率、氧化应激（活性氧生成、SOD、CAT、GPx和GSH水平）、凋亡情况（使用碘化丙啶/Hoechst双荧光染色法）以及基因毒性（通过微核、彗星试验和染色体异常检测）。结果显示，亚砷酸盐浓度越高，细胞存活率下降越明显，抗氧化酶活性受到抑制，导致氧化还原平衡失调。同时，凋亡细胞数量也随之增加。基因毒性分析显示DNA损伤、染色体异常和微核形成现象加剧。综上所述，亚砷酸盐通过破坏氧化平衡、触发凋亡及损伤基因组完整性，在TM3莱迪希细胞中引发多方面的毒性作用。这是首次通过体外实验证明亚砷酸盐对TM3细胞具有基因毒性的研究，为男性生殖系统毒性研究提供了重要补充。
引言
砷是一种天然存在于地壳中的元素，由于工业活动的增加，它已成为一种普遍的环境危害[1][2]。砷在地下水、土壤、空气和食品中的积累已成为全球性的环境问题，尤其通过饮用水污染对人类健康构成威胁[3]。世界卫生组织（WHO）指出，砷是最危险的化学物质之一，饮用水中的安全浓度应控制在10 μg/L以下[4][5][6]。国际癌症研究机构（IARC）基于大量流行病学和实验研究，将砷化合物归类为人类1类致癌物[7]。砷暴露可引发多种毒性反应，包括肝毒性、肾毒性、神经毒性和生殖毒性[8][9][10][11][12]。研究表明，砷会与细胞中的巯基（–SH）反应，破坏抗氧化系统，从而促进活性氧（ROS）的过量产生[13][14][15]。氧化应激可导致细胞死亡、突变和基因不稳定，因为会破坏DNA、蛋白质和脂质等大分子的结构[12][14]。先前的研究显示，砷暴露会导致不可逆的细胞损伤，如DNA链断裂、染色体片段化和微核形成[16][17][18]。然而，砷的基因毒性机制尚未完全阐明，特别是其对特定组织的具体影响仍需进一步研究。
男性生殖系统在发育和功能层面都极易受到各种毒性作用的影响。人类研究和实验动物模型均证实了砷对男性生殖健康的不良影响[19][20]。砷暴露会导致睾丸激素失衡、精子数量和质量下降、睾酮生成减少以及精子发生过程紊乱[21]。组织学分析显示生精小管直径变窄、生精细胞数量减少以及生殖上皮结构受损[22]。此外，砷还会通过增加睾丸体细胞（如莱迪希细胞和塞尔托利细胞）的氧化应激来触发凋亡过程[23][24][25]。研究表明，砷对男性生殖系统的毒性作用是多方面的，对生殖健康构成严重威胁。尽管已有大量关于砷在不同生物系统中毒性的证据，但其对男性生殖系统的基因毒性影响仍不够充分。
本研究的重点在于探讨亚砷酸盐（As，无机砷的三价形式）对TM3细胞的基因毒性和细胞毒性作用。我们通过体外实验评估了亚砷酸盐对TM3莱迪希细胞的毒性效应，并首次揭示了细胞应激和DNA损伤的机制基础。这项研究为理解砷对睾丸体细胞的毒性作用提供了机制上的见解，有助于进一步认识其潜在的生殖毒性。
实验材料
亚砷酸钠（NaAsO?，目录编号25480）购自印度马哈拉施特拉邦的Molychem公司。Dulbecco改良Eagle培养基/Nutrient混合物F-12（DMEM/F12）、胎牛血清（FBS）、马血清（HS）、青霉素-链霉素溶液和胰蛋白酶均购自加拿大魁北克的Wisent Bioproducts公司。碘化丙啶（PI）、Hoechst 33342（HO342）、2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）、细胞松弛素B、秋水仙素、4′,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）和Giemsa染色剂也均从相应供应商处获得。
亚砷酸盐对TM3细胞存活率的影响
使用MTT试验评估了不同浓度（1、2、4、6、8和10 μM）亚砷酸盐对细胞存活率的影响（见图1）。结果明确显示，亚砷酸盐浓度越高，细胞存活率下降越明显。基于这些结果，后续实验选择了1、2、4和6 μM的亚砷酸盐浓度。1 μM亚砷酸盐暴露使细胞存活率降低了91%，而2、4和6 μM亚砷酸盐暴露分别使细胞存活率降低了82%、63%和42%。讨论
多项研究表明，砷可通过生物化学和生理变化引起有害效应[15][17][24]。最新研究指出，砷会抑制睾酮合成并影响男性生殖系统的精子发生过程，还会破坏睾丸组织的抗氧化防御机制，从而引发氧化损伤和细胞凋亡[19][21][22][38]。结论
本研究通过多维体外分析，全面评估了亚砷酸盐对男性生殖系统的危害，揭示了其在TM3莱迪希细胞中的细胞和分子毒性作用。结果表明，亚砷酸盐浓度越高，细胞存活率下降越明显，并抑制了细胞的抗氧化防御系统。基因毒性评估（包括微核、彗星试验和染色体异常检测）的结果进一步证实了这一结论。资助信息
本研究得到了伊斯坦布尔大学科学研究项目的支持（项目编号：42110）。作者贡献声明
Yasemin AYDIN：负责写作、审稿与编辑、原始稿撰写、数据可视化、实验设计、方法学研究、概念构建。Iremnur SARIALIOGLU：负责原始稿撰写、数据可视化、方法学研究、实验设计。Gulsah ARMUT：负责原始稿撰写、数据可视化、方法学研究、实验设计。Banu ORTA YILMAZ：负责写作、审稿与编辑、原始稿撰写、数据可视化、方法学研究、资金筹集、数据分析、概念构建。利益冲突声明
作者声明：他们不存在任何可能影响本研究结果的财务利益冲突或个人关系。
