探索类弹性蛋白多肽标签和迷你内肽在利什曼原虫（Leishmania tarentolae）重组蛋白纯化中的应用

《Protein Expression and Purification》：Exploring Elastin-Like Polypeptide Tags and Mini-intein for Recombinant Protein Purification in Leishmania tarentolae

重组蛋白生产成本高，研究利用非致病真核原生动物Leishmania tarentolae表达异源蛋白，并探索弹性蛋白多肽（ELP）标签结合可自切割mini-intein ΔI-CM的纯化策略。通过硫酸铵沉淀法（0.6 M，25-30℃）实现ELP介导的高纯度蛋白纯化，成功在eGFP和牛促卵泡激素（bFSH）中验证该体系，为兽医生物制药提供低成本解决方案。

　　

卢西亚·巴塞蒂（Lucia Bassetti）| 玛蒂娜·克里斯波（Martina Crispo）| 玛丽埃拉·博拉蒂-福戈林（Mariela Bollati-Fogolin）| 塞尔吉奥·潘塔诺（Sergio Pantano）| 马塞洛·A·科米尼（Marcelo A. Comini）| 塞西莉亚·阿布雷乌（Cecilia Abreu）

乌拉圭蒙得维的亚巴斯德研究所（Institut Pasteur de Montevideo）分子、细胞与动物技术项目

摘要

重组技术使得能够生产出广泛应用于各个领域的蛋白质，包括生殖、食品补充剂和医药领域。然而，重组蛋白的生产和纯化成本高昂，这限制了它们在兽医领域的广泛应用。因此，开发低成本的生产和纯化策略对于应对这些挑战至关重要。非致病性真核原生动物Leishmania tarentolae已成为一种经济可行的异源蛋白表达系统，其糖基化特征与高等真核生物相似。尽管如此，重组蛋白的纯化成本仍然是扩大其在畜牧业等领域应用的主要障碍。

在这项研究中，我们评估了一种非传统的纯化标签——类弹性蛋白多肽（ELP），用于纯化由L. tarentolae分泌的重组蛋白。我们还探讨了使用迷你内含子ΔI-CM作为ELP与目标蛋白之间的可切割连接剂。研究发现这种内含子会在细胞内自我切割，从而无法用于基于分泌的过程。尽管存在这一限制，但在25-30°C条件下使用0.6 M硫酸铵仍可成功实现高纯度的纯化。据我们所知，这是首次在原生动物宿主中报道基于ELP的蛋白质纯化方法，为分子生物学、药物开发以及其他需要高纯度蛋白质且成本效益比高的领域提供了有前景的工具。

引言

生物技术在动物健康和生产中的应用日益广泛。生物分子的应用范围从控制传染病的疫苗^[1]，到通过调节激素或免疫系统成分来提高生产力^[2]，再到免疫阉割^[3]、繁殖目的^[4]、寄生虫控制^[5]等。这些生物分子可以通过天然提取或异源生物体中的重组表达获得。与从动物提取物中获得的蛋白质混合物相比，重组蛋白具有更高的产品一致性和安全性。重组技术还能生产自然界中不存在的蛋白质，如优化的酶或单链抗体，这些蛋白质在某些疾病的诊断和治疗中非常有用。然而，由于生产过程中的成本问题，重组产品在动物中的使用仍然受到限制^[6]。

通常，要将这些重组产物以活性形式获得，需要依赖真核生物的表达和翻译后机制。虽然哺乳动物细胞系统效果显著，但它们可能成本高昂、劳动密集且耗时较长，因此人们正在探索其他表达平台以克服这些限制。Leishmania tarentolae是一种寄生于爬行动物（尤其是蜥蜴）的单细胞真核原生动物。这种原生动物对哺乳动物（包括人类）无致病性，具有快速体外生长能力和较低的培养成本^[7]。此外，L. tarentolae具备真核生物的蛋白质折叠和翻译后修饰机制，能够以活性形式生产复杂蛋白质^[8]。有多种重组蛋白表达方法适用于L. tarentolae，包括通过组成型（基因组整合）、诱导型（基因组整合或外显子）或无细胞（基于质粒或PCR）表达系统^[9]。这些特点使其成为异源蛋白表达的理想选择。

L. tarentolae已被用于真核蛋白的表达，并通常结合色谱纯化技术^[10]。当使用L. tarentolae等替代表达系统时，总体生产成本会降低。然而，纯化过程仍占总生产成本的45%至92%^[11]。因此，为了进一步降低重组蛋白生产的总成本，必须尽量减少下游处理的费用。传统的亲和纯化方法在工业规模应用中往往成本过高，尤其是对于需要大量低成本生产的蛋白质而言。在这种情况下，基于类弹性蛋白多肽（ELP）的纯化方法提供了一种经济高效且非色谱的替代方案。

类弹性蛋白多肽（ELP）是从原弹性蛋白（tropoelastin）的疏水结构域衍生出的重复合成多肽。最常用的ELP由串联重复的(Val-Pro-Gly-X-Gly)n块组成，其中X可以是除脯氨酸以外的任何残基（因为脯氨酸会破坏ELP的逆相转变特性），“n”表示多肽中的五肽重复次数。ELP在特定温度下会迅速发生相变，这一温度称为逆相转变温度（Tt）^{12, 13}。在Tt以下，ELP在溶液中呈无序状态且可溶；但在Tt以上，非极性区域之间的分子内相互作用会导致聚集和沉淀^[14]。通过添加霍夫迈斯特系列（Hofmeister series）中的盐类，可以等温触发ELP及其融合蛋白的相变^[15]。当温度降低或盐浓度减少时，ELP的相变是可逆的^[16]。多年来，大多数ELP融合蛋白都是在大肠杆菌中生产的，也有在植物（烟草）、真菌（Aspergillus nidulans）^[17]和酵母（Pichia pastoris）^[18]中表达的报道。值得注意的是，目前尚无关于其在原生动物中应用的研究。

去除纯化标签是另一个增加生产成本的步骤，而内含子（inteins）的自切割特性为此提供了创新解决方案。内含子是通过一种称为蛋白质剪接（protein splicing）的自动催化过程从前体蛋白中切割出来的多肽序列。通过针对特定残基进行基因工程改造，内含子可以在pH变化或氧化还原剂等刺激下进行可控切割^[19]。这些工程化的内含子可以在纯化过程中去除残留的亲和标签，从而实现蛋白质的纯化。

迄今为止，大多数基于内含子的纯化研究都是使用大肠杆菌作为表达系统的。但由于内含子对温度和pH敏感，在高温（>32°C）或酸性条件下（pH <7.4）表达时容易发生过早自切割，这限制了它们在哺乳动物表达系统中的应用。

尽管存在这些挑战，内含子已在其他真核系统中成功应用，例如昆虫细胞^[20]和植物^[21]（这些系统的生长温度较低）。鉴于L. tarentolae在26°C时生长最佳，它成为探索基于内含子的重组生物分子生产策略的有希望的宿主。

在这项研究中，我们探讨了使用ELP和pH诱导型迷你内含子ΔI-CM^[22]作为L. tarentolae中异源蛋白表达的纯化系统，以增强型绿色荧光蛋白（eGFP）作为模型。为了进一步评估其适用性，该系统还用于牛促卵泡激素（bFSH）的表达测试，bFSH是牛胚胎移植中常用的超排卵外源激素。目前的商业FSH产品来源于猪或羊的垂体提取物^[23]，尽管经过数十年的研究，由于畜牧业生产的成本限制，重组FSH尚未得到广泛商业应用^[24]。最近的研究表明L. tarentolae可以生产具有糖基化和生物活性的bFSH^[10]，本研究通过固定金属离子亲和色谱（IMAC）从培养上清液中纯化了这种蛋白质。

据我们所知，这是首次在原生动物宿主中报道基于ELP的蛋白质纯化方法。这些发现证明了L. tarentolae作为一个多功能表达平台的潜力，为生物制药制造和其他资源有限环境下的生物技术应用带来了希望。

质粒构建

表达载体的构建外包给了GenScript公司。增强型绿色荧光蛋白（eGFP）的编码序列被克隆到两个商业载体中：组成型表达载体plexSY-Hyg2（Jena Bioscience）和诱导型、外显子型及双基因表达载体plexSY_IE-blecherry4（Jena Bioscience），后者同时表达目标蛋白和作为报告基因的Cherry荧光蛋白。该载体包含30个重复单位的ELP

表达ELP标签的eGFP

使用表达载体plexSY_IE-blecherry4表达了N端带有ELP标签的增强型绿色荧光蛋白（eGFP）（图1A）。该载体可实现蛋白质的诱导表达和分泌到培养基中。此外，该质粒还共表达Cherry荧光蛋白，后者留在细胞质中，有助于筛选高表达克隆。转染L. tarentolae后，根据实验方案筛选出了一个高表达克隆

讨论

生物活性分子市场的扩张推动了高效低成本生产及纯化重组蛋白方法的需求，尤其是在农业和兽医领域，这些领域的利润率通常较低^[6]。在这项研究中，我们评估了一种基于类弹性蛋白多肽（ELP）标签和迷你内含子ΔI-CM的非传统纯化系统，用于Leishmania tarentolae中的蛋白质表达。由于这种方法不依赖于

CRediT作者贡献声明

塞西莉亚·阿布雷乌（Cecilia Abreu）：撰写 – 审稿与编辑、监督、项目管理、方法学设计、资金获取、数据管理、概念构思。 马塞洛·阿尔贝托·科米尼（Marcelo Alberto Comini）：撰写 – 审稿与编辑、监督、数据管理。 塞尔吉奥·潘塔诺（Sergio Pantano）：撰写 – 审稿与编辑。 玛丽埃拉·博拉蒂-福戈林（Mariela Bollati-Fogolin）：撰写 – 审稿与编辑。 玛蒂娜·克里斯波（Martina Crispo）：撰写 – 审稿与编辑。 卢西亚·巴塞蒂（Lucia Bassetti）：撰写初稿、方法学设计、实验研究。

未引用参考文献

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利益冲突声明

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