锰掺杂磷酸钙涂层增强成骨与成血管潜力：生物材料筛选揭示骨修复新策略

《ACS Biomaterials Science & Engineering》：Biomaterial Screening Identifies Enhanced Osteogenic and Angiogenic Potential of Mn-Doped Calcium Phosphate Coatings

本研究通过构建铜(Cu2+)、镁(Mg2+)、锰(Mn2+)、锶(Sr2+)、锌(Zn2+)等离子掺杂的碳酸化磷灰石(CaP)涂层文库，系统筛选并鉴定出高锰掺量(CaMnP1000)材料。该材料能显著上调人间充质干细胞(hMSCs)的RUNX2、BMP2、OCN等成骨基因及VEGF-A、ANG-1等血管生成因子，并促进人脐静脉内皮细胞(HUVEC)形成管状网络，展现出优异的成骨、成血管及促炎症修复潜能，为骨缺损修复提供了兼具骨诱导与血管化功能的新型生物材料。

　　

内容归纳总结：

1. 引言

自体骨移植因其优异的骨愈合性能而被广泛应用于临界尺寸骨缺损的治疗，但其存在供体来源有限、供区并发症等显著缺点。磷酸钙(CaP)基合成生物材料因其生物相容性好、与骨无机成分相似而成为有前景的替代品，但其骨修复再生性能常不及自体移植物，因此需要进一步优化。掺入无机添加剂被认为是一种在不影响其合成特性的前提下提升性能的有效策略。

2. 材料与方法

研究首先通过模拟体液沉积法构建了一个由10种不同离子掺入的碳酸化磷灰石涂层组成的高通量材料库。掺入的离子包括Cu²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Sr²⁺和Zn²⁺，每种离子设定了低(1 μM或10 μM)和高(1000 μM)两种掺入浓度，具体涂层名称及最终溶液浓度见原文表1。

使用X射线衍射(XRD)、傅里叶变换红外光谱(FTIR)、扫描电子显微镜(SEM)和电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)对涂层进行物化表征。XRD和FTIR分析证实所有涂层均为低结晶度的碳酸化磷灰石，SEM显示所有条件下均形成了均匀的CaP涂层。

将人间充质干细胞(hMSCs)接种于各涂层上培养至21天，采用包含成骨、血管生成和炎症相关标志物的17重蛋白多重检测试剂盒对细胞上清和裂解液进行蛋白表达谱筛选。通过实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测成骨相关基因(RUNX2、BMP2、OPN、OCN)的表达。使用碱性磷酸酶(ALP)活性测定评估成骨分化中期标志物。通过MTT法测定细胞代谢活性，并用鬼笔环肽(phalloidin)染色观察细胞形态。

为了验证筛选结果，使用培养第7天hMSCs的条件培养基，在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)上进行血管生成出芽实验，评估其促血管生成能力。使用AngioTool软件分析血管网络的总面积、平均管腔长度和分支节点数量。

3. 结果

3.1. 材料表征与离子释放动力学

材料表征证实成功构建了成分与结构均一的涂层文库。ICP-MS动态监测显示，不同涂层具有差异化的离子释放动力学。CaMnP1000涂层在21天的培养周期内持续释放锰离子(⁵⁵Mn)，其累积释放量在所有时间点均显著高于对照CaP涂层。此外，含镁涂层(CaMgP1000和CaMgP10)表现出持续的钙(⁴⁴Ca)和磷(³¹P)释放特性。

3.2. 细胞相容性与形态学

MTT测定显示，大多数涂层支持hMSCs的代谢活性。其中，CaP、CaMgP (1000和10)和CaSrP10涂层在培养第12天促进了细胞代谢活性。相反，高浓度铜涂层CaCuP10在培养第12天和第26天均显著降低了细胞代谢活性，表明其存在细胞毒性。细胞形态学观察证实了这一点：hMSCs在CaCuP10上呈圆形，铺展受限；而在CaZnP10上则呈现更多纺锤状形态。

3.3. 高通量蛋白筛选鉴定出CaMnP1000的独特效应

通过蛋白多重检测对材料库进行筛选。主成分分析(PCA)显示，在培养第7天和第21天，hMSCs在CaMnP1000上的蛋白表达谱均与其他材料明显分离，形成了一个独立的簇，表明该材料诱导了独特的细胞反应。

具体而言，与对照组相比：

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  成骨相关蛋白：培养第21天，hMSCs在CaMnP1000上表现出骨桥蛋白(OPN)、骨形态发生蛋白-2(BMP-2)、基质金属蛋白酶-13(MMP-13)和腱生蛋白-C(TN-C)等蛋白水平的显著上调。
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  血管生成相关蛋白：在培养第7天，hMSCs在CaMnP1000上即表现出血管内皮生长因子-A(VEGF-A)表达升高。到第21天，血管生成素-1(ANG-1)和VEGF-A的表达均显著增加。
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  炎症相关细胞因子：在培养第7天，hMSCs在CaMnP1000上的白细胞介素-6(IL-6)表达高于BM对照组。到第21天，其IL-6、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达谱与BM组相似，但相对于CaP对照组升高，提示其可能调控炎症微环境以利于修复。

3.4. 成骨基因表达验证

RT-qPCR结果进一步验证了CaMnP1000的成骨诱导能力。与BM对照组相比，hMSCs在CaMnP1000上：

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  早期成骨标志基因RUNX2在培养第7天显著上调。
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  BMP2基因表达从第7天到第21天持续上调。
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  晚期成骨标志基因OCN在第14天和第21天均显著上调。

3.5. 促血管生成功能验证

HUVEC出芽实验是关键的功能验证。将hMSCs在CaMnP1000上培养第7天的条件培养基添加到HUVEC培养基中，结果显示：

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  与添加hMSCs在BM中条件培养基的对照组相比，添加CaMnP1000条件培养基的HUVEC形成了更长的血管样结构(平均管腔长度增加)。
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  同时，血管网络的连接节点数也显著增多。
  这些结果表明，CaMnP1000诱导hMSCs分泌的因子能够有效促进内皮细胞的血管生成行为。

3.6. 碱性磷酸酶活性

值得注意的是，在所有测试的CaP涂层上，hMSCs的ALP活性相对于BM对照组均呈下降趋势，包括CaMnP1000。这表明在该实验体系中，ALP活性可能并非评价这些涂层成骨潜能的敏感或唯一指标，基因和蛋白水平的调控更为关键。

4. 讨论

本研究通过系统性的生物材料筛选，成功从离子掺杂CaP涂层文库中鉴定出CaMnP1000作为最具潜力的候选材料。其核心优势在于同时增强了hMSCs的成骨和成血管潜力。

机制探讨：锰离子的持续释放可能是其发挥功能的关键。锰作为超氧化物歧化酶2的辅因子，可能通过调节活性氧(ROS)信号通路影响细胞行为。有文献指出，锰释放材料可通过调节细胞内氧化应激和激活低氧诱导因子-1(HIF-1)信号通路来促进VEGF介导的血管生成。同时，锰也可能通过Smad依赖的TGF-β/BMP信号通路促进MSC的成骨分化。本研究中观察到的早期炎症因子(如IL-6)上调，可能有助于募集MSCs并创造促再生微环境，而后期向促修复细胞因子谱的转变则有利于血管稳定和成骨分化。

研究意义与局限：该研究证明了高通量蛋白筛选在生物材料评价中的有效性。CaMnP1000展现出促进骨形成与血管化的双重功能，这对于大段骨缺损的修复至关重要，因为成功的骨再生高度依赖于及时的新生血管化以输送营养和氧气。然而，本研究主要在二维平面涂层上进行，未来需要转向更贴近生理环境的三维培养模型进行验证，并进一步开展体内动物实验，以明确其骨修复效能及生物安全性，为最终临床应用奠定基础。