修饰性多环化合物在1型强直性肌营养不良症疾病模型中拯救剪接缺陷

《ACS Chemical Biology》：Modified Polycyclic Compounds Rescue Mis-splicing in Myotonic Dystrophy Type 1 Disease Models

这项研究报道了一类基于二脒结构设计的新型修饰性多环化合物（Modified Polycyclic Compounds, MPCs），它们以低纳摩尔浓度特异性结合并减少致病性CUGexp重复RNA，从而解除MBNL蛋白的扣押、挽救数千个剪接错误事件，并在DM1患者来源细胞系及小鼠模型中展现出低毒性与治疗潜力，为靶向RNA毒性增益机制提供了有前景的先导分子。

　　

引言

强直性肌营养不良1型（Myotonic dystrophy type 1, DM1）是成人最常见的肌营养不良症，由_DMPK基因3′非翻译区（3′UTR）CTG三核苷酸重复序列不稳定扩增引起。产生的扩展CUG重复RNA（CUG_exp）通过“毒性增益功能”机制，扣押了调控选择性剪接的肌肉盲样（Muscleblind-like, MBNL）RNA结合蛋白家族，导致数千个剪接事件失调。许多失调的剪接事件已被证实与DM1表型直接相关，例如肌强直（_CLCN1外显子7a）、心脏传导缺陷（_TNNT2外显子5）和胰岛素抵抗（_INSR外显子11）。既往研究表明，如喷他脒、呋喃脒等二脒类化合物能够挽救DM1剪接失调，但其应用因肝、肾毒性及在接近毒性浓度下才起效而受限。本研究旨在设计、合成并测试一系列基于二脒结构的新型修饰性多环化合物（Modified Polycyclic Compounds, MPCs），以期获得疗效更佳且毒性更低的候选药物。

结果与讨论

MPCs在DM1患者来源成纤维细胞系中挽救剪接缺陷

研究团队以二脒类化合物为灵感，开发了由杂环核心、苯并咪唑侧基和功能化末端基团三个核心元素构成的MPCs系列化合物。在DM1患者来源成纤维细胞系（GM04601）中，通过检测_INSR外显子11和_FLNB外显子31的剪接修复情况，筛选了10种MPC化合物。结果表明，MPC03和MPC04在低纳摩尔浓度（<100 nM）下即可显著挽救剪接缺陷，且未表现出明显的细胞毒性（毒性浓度约为有效浓度的1000倍）。相比之下，MPC02活性较弱，而改变核心基团取向（如MPC05、MPC06）、替换核心（如MPC07、MPC08）或移除侧基（如MPC09、MPC10）的化合物均丧失了剪接修复活性，证明MPC核心各组分的特定结构及相对取向对其功能至关重要。

MPCs在两种DM1成肌管模型中挽救剪接缺陷并影响_DMPK和_MBNL1表达

研究进一步在携带不同长度CTG重复序列（DM1-A约2900次，DM1-B约1300次）的DM1患者来源成肌管模型中评估了效果最佳的三种MPC（MPC02、MPC03和MPC04）。通过检测_MBNL1外显子5和_NUMA1外显子16的剪接修复发现，所有三种MPC都能部分挽救剪接失调，其中MPC04效果最强，在极低浓度下即可实现高达71%的_MBNL1外显子5修复，且未观察到细胞毒性。值得注意的是，MPC04在重复次数较少的DM1-B细胞系中起效浓度更低，EC₅₀约为1.5-1.6 nM。机制研究发现，MPC04处理降低了_DMPK转录本水平和CUG核糖核蛋白病灶数量，并同时上调了_MBNL1和_MBNL2的RNA及蛋白表达水平。

MPC04在DM1成肌管中挽救数百个外显子跳跃事件且脱靶效应有限

利用RNA测序技术进行的全局分析显示，MPC04能够以剂量依赖性的方式挽救DM1成肌管中数千个失调的“外显子跳跃”剪接事件。在DM1-A细胞系中，125 nM MPC04处理可挽救约60%的失调剪接事件。在未受影响的对照成肌管中，MPC04仅引起少量剪接事件改变，表明其脱靶效应相对有限。同样，MPC04也能够挽救数千个失调的基因表达事件，被挽救的基因显著富集于肌肉器官发育、骨骼肌收缩等相关生物过程。

MPC04能在HSA^LR小鼠模型中调节剪接和基因表达

在广泛使用的HSA^LRDM1小鼠模型中，通过腹腔注射MPC03和MPC04（20 mg/kg，连续5天）进行评估。结果显示，两种MPC均能部分挽救_Atp2a1外显子22、_Clcn1外显子7a和_Mbnl1外显子5的剪接缺陷，并显著降低表达CUG_exp的_ACTA1转基因水平，但对内源性_Dmpk或_Mbnl1表达无影响。这一发现支持MPCs通过降低CUG_expRNA水平在体内发挥治疗作用。

MPC04不影响缺乏CUG重复序列的C2C12小鼠成肌细胞中的剪接和基因表达

在仅含1个CTG重复的小鼠C2C12成肌细胞中，MPC04处理不影响_Dmpk、_Mbnl1表达及剪接模式。然而，在含有正常长度CTG重复（5-34次）的人类未患病成肌细胞中，MPC04却能降低_DMPK表达并上调_MBNL1表达。这些数据表明，MPCs的活性依赖于CUG重复RNA的存在，且其作用可能具有物种特异性或与重复长度相关。

MPC04结合CUG RNA

等温滴定量热法实验证实，MPC04能以极高的亲和力与r(CUG)₈RNA结合，其解离常数K_d为1-3 nM，表现出多分子与单条RNA双链结合的特征。相比之下，它与DNA双链的结合亲和力弱数百倍。活性较弱的MPC03（K_d约180 nM）和无活性的MPC05（K_d约2900 nM）与RNA的结合亲和力依次降低，这与它们在细胞中的活性表现一致。分子对接模型为MPC04可能的结合模式提供了假设，包括在RNA双链的大沟/小沟结合或通过芳香核与碱基对堆叠发生部分嵌入。荧光指示剂置换实验也支持MPC04可通过嵌入或沟槽结合的方式与RNA相互作用。

总结

本研究成功设计并鉴定了一类新型修饰性多环化合物（MPCs）。其中，先导化合物MPC04和MPC03在DM1患者来源的成纤维细胞和成肌管模型中，能在低纳摩尔浓度下高效、特异地挽救剪接缺陷，降低致病性_DMPK/CUG_expRNA水平，并上调MBNL蛋白及转录本表达，且未表现出明显的细胞毒性。作用机制研究支持MPCs通过高亲和力结合CUG_expRNA，从而解除MBNL蛋白的扣押，恢复其正常的剪接调控功能。全局RNA测序分析证实MPC04能够广泛挽救DM1中失调的剪接和基因表达网络，且脱靶效应有限。在HSA^LR小鼠模型中的体内实验也验证了其部分治疗效果。尽管MPCs在类药性等方面仍需进一步优化，但该类化合物为开发靶向RNA毒性增益机制、治疗DM1及其他重复扩展疾病提供了新的、有前景的先导分子骨架。