《ACS Chemical Neuroscience》：Imidazole as a Pendant Reactivation Ligand Increases Efficacy Scope for Reactivation and Resurrection of Organophosphorus-Inhibited/Aged Cholinesterases by Quinone Methide Precursors
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本文推荐一项创新研究，其开发了新型醌甲基前体（QMP）疗法，通过引入咪唑等N-杂环作为侧链再活化配体，成功实现了对多种有机磷（OP）化合物抑制及“老化”的乙酰胆碱酯酶（AChE）和丁酰胆碱酯酶（BChE）的再活化与“复活”，显著拓宽了治疗范围，为应对有机磷中毒这一致命威胁提供了极具潜力的新型双功能治疗策略。
引言
有机磷（OP）化合物通过共价抑制乙酰胆碱酯酶（AChE）的催化丝氨酸残基发挥其毒性，导致神经递质乙酰胆碱（ACh）无法水解，在中央和周围神经系统中积聚，可能引起呼吸衰竭而致命。这类化合物不仅被用于恐怖活动，也广泛作为农药使用。目前，肟类药物是治疗OP抑制态AChE的常用方法，其通过亲核置换磷酰化丝氨酸上的磷来恢复酶功能，这一过程称为“再活化”。然而，肟类药物存在显著局限性：多数难以穿透血脑屏障（BBB）；无一能有效对抗OP“老化”形式的AChE（即抑制态发生自发O-脱烷基化后形成的带氧负离子的磷酰化丝氨酸，对肟类药物具有抗性）；且再活化过程可能产生有毒副产物。此外，不同的OP化合物会产生结构各异的磷酰化丝氨酸，使得美国食品药品监督管理局（FDA）批准的肟类疗法无法对所有OP抑制形式的AChE生效。
丁酰胆碱酯酶（BChE）是另一种丝氨酸水解酶，与AChE结构相似，也可被OP化合物抑制。尽管其生化功能未知，但BChE可作为OP暴露的化学计量清除剂。若能再活化和/或“复活”OP抑制/老化的BChE，该酶将能继续清除额外的OP化合物，从而起到伪催化生物清除剂的作用。因此，一种能够恢复OP抑制/老化的AChE和BChE的治疗方法，可能为OP暴露提供最佳的生存机会。
2018年，研究团队首次利用新型醌甲基前体（QMP）方法，在体外实现了对甲基膦酸酯老化AChE的恢复。将老化酶恢复至天然形式的过程被Quinn称为“复活”。其假设机制涉及醌甲基（QM）的形成，QM作为亲电子试剂与亲核的氧负离子反应。再烷基化后，磷酰化丝氨酸处于更类似于酶抑制态的状态，随后苯酚（或其共轭碱或外部碱）被假设作为再活化剂使酶恢复天然形式。然而，这个过程缓慢且困难。此前，团队也展示了首个能够同时执行OP抑制/老化AChE再活化与复活的双功能疗法，但许多化合物未能对所有OP抑制/老化形式展现出令人印象深刻的效能，表明需要对再活化剂/复活剂部分进行优化。
2015年，Katz等人证明，OP抑制AChE的再活化不仅限于肟和曼尼希酚部分，也可以使用咪唑作为碱性功能团（通过先导化合物SP134）来实现。咪唑被认为不是通过直接亲核加成，而是通过激活水分子来完成再活化步骤。这种水介导的再活化优于亲核攻击，因为生成的氢磷酸酯或膦酸盐是酸性的，从而在生理pH下形成无害的磷酸盐副产物。相比之下，吡啶肟再活化剂在再活化过程中会产生有毒副产物。尽管有此优势，咪唑再活化剂的研发进展甚微，大多数研究仍集中在带电荷的肟再活化剂上。
研究假设与策略
本研究假设，将咪唑连接到QMP骨架上，能使咪唑作为侧链再活化剂部分，既用于OP抑制胆碱酯酶的再活化，也用于QMP介导的OP老化AChE复活机制中的再活化步骤。为此，研究团队合成了24种新型QMP治疗化合物（包含20种独特骨架），每种都包含一个N-杂环基团（咪唑、苯并咪唑或吡唑），并假设该N-杂环基团可能在活性位点既作为结合配体，又作为再活化部分，从而大幅提高双功能QMP疗法的范围与效能。
N-杂环QMP化合物的合成
研究通过多种合成路线合成了24种QMPs。例如，框架1a–e（对位连接咪唑）的合成利用了一种通过瞬态醌甲基介导的亲核取代反应，然后进行曼尼希反应引入胺基团。为了探究区域化学的影响，合成了咪唑连接在酚环5位（间位，化合物3）和6位（邻位，化合物4）的类似物。受SP134启发，还合成了延长QMP环与咪唑之间碳链长度的化合物（5–12），以探索不同的结合姿态。此外，为了研究结合相互作用和空间效应，还将咪唑替换为苯并咪唑（13–18）、2-甲基咪唑（19）和吡唑（20），共计20种独特框架。
N-杂环QMP化合物（1–20）的生化体外评估
研究通过体外生化评估测试了这些QMP疗法对多种OP抑制及老化形式的AChE和BChE的效能。
对OP抑制AChE的再活化
首先测试了化合物对OEt抑制AChE的再活化能力（pH 7.5, 37°C, 250 μM, 1小时）。多个QMP疗法在1小时内几乎能完全恢复酶的活性，优于肟类对照药。通过热图分析对所有八种OP抑制形式AChE的广谱再活化效能发现：
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胺离去基团的影响：与之前研究不同，二乙胺（1b）比(R)-2-甲基吡咯烷（1d）表现更佳，表明胺在活性位点的结合并非再活化的唯一贡献因素，咪唑可能作为外部碱发挥了作用。
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区域化学的影响：咪唑连接在酚环4位（对位，如1d）的化合物展现出对多种OP抑制形式的再活化能力。连接在5位（间位，如3）的化合物对MP抑制AChE的再活化较差，但对(OEt)(NMe2)-、EP-和DFP-抑制的AChE再活化更强。连接在6位（4）则基本无效。
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碳链延长的影响：在对位延长碳链（5–8）对再活化益处不大，甚至在某些方面弱于1d。而在间位延长碳链（特别是9和11）则表现出最佳的再活化效果，其中11是唯一能对所有八种OP抑制形式AChE中的七种实现显著再活化（>20%）的化合物（对DFP抑制型为17%）。
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N-杂环类型的影响：苯并咪唑类化合物（13–18）的再活化效能普遍不如1d、9和11。2-甲基咪唑（19）保留了部分活性。吡唑（20）则基本丧失了再活化能力。
对OP老化AChE的复活
评估化合物对四种OP老化形式AChE的复活能力（250 μM, 24小时）发现：
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1b和1d在250 μM浓度下能复活甲基膦酸酯老化（5%）、MP老化（8%）、EP老化（>65%）和DFP老化（>15%）的AChE。
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与再活化趋势相反，苯并咪唑类框架（13–18）对OP老化形式的酶复活效果更强，其中13和18对甲基膦酸酯老化AChE的复活率最高（约10%）。对比17（保留N-H）和18（N-甲基化）表明，缺乏N-H氢键供体、保留N-甲基对更高效能更有利。
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尽管吡唑20再活化能力极差，但其对甲基膦酸酯老化AChE的复活率达到11%，是该浓度和时间下此前未见的最高恢复记录。
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兼具一定再活化和较好复活能力的化合物包括5、6以及19。
数据表明了一个有趣趋势：4位（对位）连接在再活化和复活两方面都表现出更好的广谱效能平衡；5位（间位）连接则再活化优异但缺乏复活能力。研究者推测这可能是咪唑与磷酰化丝氨酸残基之间反应距离的影响。在复活机制中，间位连接的咪唑距离胺离去基团更远，因此在再烷基化后协助后续再活化步骤的能力较弱，而对位连接的咪唑则能提供更近的反应距离。
对OP抑制BChE的再活化
测试化合物对七种OP抑制形式BChE的再活化（250 μM, 1小时）发现：
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1b是广谱性最好的再活化剂，对所有测试的抑制形式都显示出再活化能力，但其效能趋势与肟类再活化剂几乎相反。
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苯并咪唑类基团在OP抑制BChE中表现出更强的再活化效能，可能因为BChE更大的活性位点空间可以容纳苯并咪唑的芳基基团。例如，18对OCy抑制BChE的复活率达到37%，远高于肟类的9%。
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11在OP抑制AChE上表现最佳，在OP抑制BChE中也具有合理的再活化效能。
然而，在测试条件下（250 μM, 24小时），所有化合物对OP老化BChE均未检测到复活作用。
结论
将咪唑作为侧链再活化部分连接到QMP双功能疗法中，成功提高了对OP抑制/老化胆碱酯酶的再活化与复活范围。在所合成的QMP化合物中，针对每一种OP抑制和OP老化的AChE结构，至少有一种化合物能实现足够的再活化或复活。
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咪唑的连接位置（区域化学）对疗效有实质性影响：4位（1d）在再活化与复活效能间取得平衡；5位（3）再活化优异但缺乏复活能力；6位（4）基本无效。
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延长连接碳链对某些效能有提升，对另一些则有降低。
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将咪唑换为苯并咪唑通常会降低再活化效能，但能增加复活效能。
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将咪唑换为吡唑（20）会导致再活化能力完全丧失，但意外地提高了对甲基膦酸酯老化AChE的复活率至前所未有的水平。
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该疗法在BChE方面仍需优化，因为它们对许多OP抑制形式的酶效果不佳，且无法复活OP老化的BChE。
在20种化合物的N-杂环化学库中，特定的QMP衍生物如1b、1d、5和6，能对多种OP抑制的AChE/BChE提供广谱再活化，并复活OP老化的AChE——这一特性在医疗专业人员可能不清楚具体涉及哪种OP毒物时至关重要。而该库中的其他QMP化合物（如1b、1d、3、9、11和20）虽作为广谱疗法效果较差，但在某一特定类别中提供了优异的转化效果。总之，本研究显示咪唑基团可能是未来优化OP暴露疗法、提升效能范围的关键。
