《ACS Applied Bio Materials》：Simultaneous Cross-Linking and Nanoparticle Anchoring by Dialdehyde Cellulose in Injectable Composite Chitosan/Polypyrrole Hydrogels
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本文报道了一种创新性的可注射、自愈合复合水凝胶。研究者以水溶性半乙酰化壳聚糖（SCN）和双醛纤维素（DAC）为基础，首次利用DAC的双重化学反应性，在通过动态希夫碱（Schiff base）交联SCN的同时，通过醛醇缩合（aldol condensation）共价锚定聚吡咯（PPy）纳米粒子。该水凝胶展现出剪切稀化、可注射性、快速自愈合、良好的细胞相容性、抗炎活性以及促进细胞迁移和伤口愈合的能力，为开发高级伤口敷料提供了一个极具前景的平台。
1. 引言
在生物医学领域，可注射水凝胶在组织再生、伤口愈合、药物递送等方面具有广泛应用前景。其中，壳聚糖（chitosan）因其良好的生物相容性、可降解性、抗菌性和低毒性而备受关注。然而，其在生理条件下的不溶性限制了其在可注射制剂中的应用。为此，研究者开发了多种水溶性壳聚糖衍生物，但这通常涉及引入非生理性的合成基团，可能导致降解产物的长期影响未知。另一种方法是使用水溶性半乙酰化壳聚糖（SCN），它通过将脱乙酰度（DD）控制在约50%来实现生理pH下的溶解，不引入人工基团，更具天然优势。
为获得可注射的壳聚糖基水凝胶，需通过动态共价键（可逆的希夫碱反应）进行交联。传统的交联剂如戊二醛有毒性，而由纤维素区域选择性氧化制得的双醛纤维素（DAC）毒性显著更低、可在体内生物降解，且交联效率更高，是一个理想的替代品。
与此同时，导电聚合物聚吡咯（PPy）在伤口敷料和组织工程中展现出吸引力，不仅因为其导电性，还因其清除活性氧、减轻促炎信号传导、调节细胞粘附和迁移的能力，有助于组织修复。近期研究发现，DAC具有与PPy自发结合的独特能力，可通过醛醇缩合反应锚定PPy。
本研究的创新之处在于，首次将DAC的这种双重化学作用（既与SCN形成动态希夫碱交联，又与PPy共价锚定）整合到一个体系中，构建了兼具可注射性、自愈合性、生物活性的复合水凝胶，这为处理不规则伤口（包括体内伤口）开辟了新途径。
2. 方法
2.1. 材料
实验使用了吡咯、三氯化铁、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、SigmaCell 20型纤维素、高碘酸钠、乙二醇、低分子量壳聚糖、冰醋酸、无水乙醇、乙酸酐、氢氧化钠等试剂，均为分析纯。
2.2. SCN、DAC和PPy的制备
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SCN制备：参照Qin等人的方法，通过壳聚糖的部分再乙酰化制备。经核磁共振（NMR）测定，所得SCN的脱乙酰度为46%，在水和pH 7的PBS中溶解度可达15 mg/mL。1H NMR谱图。">
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DAC制备：通过高碘酸钠氧化纤维素制备，氧化度达94 ± 2%。凝胶渗透色谱（GPC）测得其分子量（Mw）为7600 Da。
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PPy制备：采用PVP稳定的氧化聚合方法合成胶体。动态光散射（DLS）测得PPy胶体的流体力学直径为189 ± 3 nm，多分散指数0.23，Zeta电位为4.3 ± 0.5 mV。
2.3. 可注射水凝胶的制备
制备了四种水凝胶样品：不含PPy的SCN_DAC_10%和SCN_DAC_20%（其中10%和20%为DAC相对于SCN的摩尔分数），以及含5 wt% PPy的SCN_DAC_10%PPy和SCN_DAC_20%PPy。具体配比见表1。将SCN和DAC溶液分别吸入注射器，通过硅胶管连接并来回推注混合，静置过夜形成水凝胶。
2.4. 样品表征与仪器
使用了多种技术进行表征：傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、凝胶渗透色谱（GPC）、核磁共振（NMR）、X射线光电子能谱（XPS）、动态光散射（DLS）、流变学分析、扫描电子显微镜（SEM）、电导率测量。生物评价包括细胞毒性（NIH/3T3成纤维细胞）、划痕实验（伤口愈合）以及免疫调节活性评估（RAW 264.7巨噬细胞，检测一氧化氮NO和白介素-6 IL-6分泌）。
3. 结果与讨论
3.1. SCN、DAC和PPy的表征
FT-IR和NMR证实了SCN的成功制备与表征。XPS分析为DAC的双重功能提供了直接证据：在不含PPy的样品N 1s谱图中观察到亚胺离子信号，证实了DAC与SCN之间形成了希夫碱；在含PPy样品的C 1s谱图中，C–OH信号相对于C=O信号的增强，以及新出现的C=C信号，支持了DAC与PPy之间发生了醛醇缩合反应。
3.2. 水凝胶的表征
3.2.1. 流变学测量
所有样品均表现出以弹性为主的凝胶行为，储能模量（G′）在25至47 Pa之间。含20% DAC的样品（SCN_DAC_20）模量最高。添加PPy后，G′略有下降，推测是PPy纳米颗粒消耗了部分DAC交联剂，导致主体网络交联密度局部变化。
水凝胶表现出明显的剪切稀化行为，粘度随角频率增加而下降，这是良好可注射性的标志。应变扫描显示，样品在低应变下呈线性粘弹性，在高应变下（约100%）发生从凝胶到溶胶的转变，表现出III型非线性粘弹性行为（弱应变硬化）。含PPy的样品（SCN_DAC_20_PPy）其交叉点（G′ = G″）对应的应变幅度更低，可能与网络拓扑结构变化有关。
循环应变测试证明了水凝胶优异的自愈合能力：在1000%高应变下网络破坏（溶胶状态），一旦应变恢复至0.2%，数秒内即可恢复凝胶结构。所有水凝胶均可成功通过21G（0.8 mm）针头注射。
3.2.2. 形貌与电导率
SEM显示干燥后的水凝胶呈片状结构，含PPy的样品中可见PPy颗粒良好分散于水凝胶中。所有水凝胶样品在溶胀状态下的电导率约为0.3 ± 0.05 mS/cm，处于皮肤等生物组织的生理电导率范围内，有利于支持细胞电信号传导，即使没有外部电刺激。
3.3. 生物学评价
3.3.1. 细胞相容性
按照ISO 10993-12标准，水凝胶提取物对NIH/3T3成纤维细胞无显著细胞毒性。共培养实验显示，成纤维细胞在水凝胶存在下生长良好，保持正常形态，表明材料具有良好的细胞相容性。
3.3.2. 体外伤口愈合促进
划痕实验表明，所有水凝胶均能加速NIH/3T3细胞的迁移，促进“伤口”闭合。培养10小时后，残留伤口面积百分比分别为：对照组83 ± 7%，SCN_DAC_10 为65 ± 2%，SCN_DAC_10_PPy 为63 ± 5%，SCN_DAC_20 为65 ± 3%，而SCN_DAC_20_PPy 效果最显著，降至39 ± 2%。
3.3.3. 水凝胶对巨噬细胞反应的影响
巨噬细胞在伤口愈合的各阶段都起着关键作用。研究评估了水凝胶对脂多糖（LPS）刺激的RAW 264.7巨噬细胞的影响。
MTT实验表明，除最高浓度的SCN_DAC_10_PPy外，水凝胶对巨噬细胞无明显细胞毒性。所有四种水凝胶均能降低LPS刺激的巨噬细胞中一氧化氮（NO）的产生。然而，只有含PPy的水凝胶能显著降低白细胞介素-6（IL-6）的分泌。
这些结果表明，SCN和DAC提供了基础的抗炎微环境，而PPy进一步将巨噬细胞反应向促炎性较低的表型调节，有助于伤口从炎症期向修复期过渡。
4. 结论
本研究成功制备并表征了一种基于水溶性半乙酰化壳聚糖（SCN）和双醛纤维素（DAC）的可注射、自愈合复合水凝胶，其中共价锚定了聚吡咯（PPy）纳米粒子。DAC作为双功能交联剂，通过希夫碱反应交联SCN，同时通过醛醇缩合锚定PPy。该水凝胶体系展现出优异的剪切稀化、可注射性、快速自愈合特性，以及良好的细胞相容性。生物学评价证实，该材料能有效促进成纤维细胞迁移（伤口愈合），并具有抗炎活性（降低NO和IL-6分泌），其中SCN_DAC_20_PPy样品表现最佳。这些特性使得SCN/DAC/PPy可注射水凝胶成为开发先进伤口敷料的一个极具前景的平台材料。
