大肠杆菌谷氨酸脱羧酶中天冬氨酸86在催化机制中的作用：揭示其在底物结合、产物释放及溶剂动力学同位素效应中的关键角色

《Biochemistry》：Role of Aspartate 86 in the Catalytic Mechanism of Escherichia coli Glutamate Decarboxylase

本文深入探讨了大肠杆菌谷氨酸脱羧酶中高度保守的Asp86残基的多重功能。研究结合光谱学和动力学分析发现，Asp86不仅参与酸性pH下的底物结合，还对产物γ-氨基丁酸的释放起关键作用，并且是导致该酶产生巨大溶剂动力学同位素效应的主要因素。通过构建双突变体GadB_D86N-H465A，研究揭示了Asp86突变可显著拓宽酶的最适pH范围至7-8，这不仅深化了对细菌酸应激耐受机制的理解，也为基于生物法高效合成GABA及其类似物提供了具有应用潜力的工程化酶。

　　

谷氨酸脱羧酶是依赖于磷酸吡哆醛的酶，广泛存在于生物体中，催化L-谷氨酸不可逆的α-脱羧反应，生成γ-氨基丁酸和CO₂。在大肠杆菌中，该酶是其谷氨酸依赖性酸抵抗系统的关键组成部分，通过消耗质子来帮助细菌抵御酸性环境压力。研究最为深入的大肠杆菌GadB在pH 4–5时活性最高，而在pH ≥ 6.0时活性无法检测，这与其活性位点在pH升高时被His465“封闭”有关。

天冬氨酸86的推定作用与双突变体构建

在GadB的活性位点中，除了His465，另一个高度保守的残基Asp86引起了研究者的注意。在低pH的活性构象中，Asp86的侧链朝向活性位点，被认为可能负责结合L-谷氨酸的γ-羧酸根基团。为了在pH > 5.5的条件下（此时His465会导致酶自失活）全面评估Asp86的作用，研究将D86N点突变引入到已存在的GadB_H465A单突变体中，构建了双突变体GadB_D86N-H465A。该双突变体的表达、纯化及基本酶学性质研究表明，其比活性约为野生型酶的64%，且底物特异性未发生改变。

光谱学性质分析

对GadB_D86N-H465A的紫外-可见吸收光谱分析显示，其存在pH依赖性的420 nm → 332 nm光谱转变。与野生型酶在pH > 6.0时主要形成340 nm吸收的取代醛胺不同，双突变体在pH 9.1时虽然332 nm吸收的烯醇亚胺物种占主导，但420 nm吸收的酮烯胺物种仍然可被检测到。拟合分析表明，其光谱转变的中点与GadB_H465A相似，但远高于野生型酶，且协同性（希尔系数）几乎消失。光谱解卷积进一步证实，在双突变体中，无论pH是4.6还是8.8，其谱图仅由330 nm（烯醇亚胺）和418 nm（酮烯胺）两个物种组成，取代醛胺完全缺失。这些结果表明，H465A突变是导致取代醛胺被烯醇亚胺互变异构体替代的主要原因。

催化动力学与溶剂动力学同位素效应

对野生型GadB、GadB_H465A和GadB_D86N-H465A在pL 4.6–5.0范围内的动力学参数测定显示，双突变体的K_M值和k_cat值均高于野生型和单突变体，但由于K_M增加更为显著，其特异性常数反而更低。K_M的升高很可能与Asp86的替换有关，该残基在功能性二聚体中由相邻亚基提供，并在酶活化过程中发生显著的侧链重定向。

研究特别关注了溶剂动力学同位素效应。在D₂O中，野生型GadB和GadB_H465A的^D₂Ok_cat约为7-8，这是一个在酶促反应中罕见的巨大效应。而双突变体GadB_D86N-H465A的^D₂Ok_cat则降至约3。由于k_cat包含了底物结合后所有步骤的速率常数，这一巨大差异表明，Asp86（在双突变体中被替换）在催化步骤中扮演着关键角色，而不仅仅是影响底物结合。这一发现出乎意料，因为最初认为Asp86仅通过其侧链羧酸根基团的质子化状态来影响底物结合。

质子库存研究

为了更深入理解溶剂同位素效应，研究进行了质子库存分析。对于野生型GadB，k_cat对氘分数（n）的依赖关系呈现明显的向下弯曲曲线（超曲率），表明有多个质子转移贡献于^D₂Ok_cat。数据最佳拟合了一个“多通道”模型，涉及两个过渡态分馏因子。相反，双突变体GadB_D86N_H465A的曲线下弯程度小得多，仅涉及一个过渡态分馏因子，符合“无限”质子转移模型。这表明D86N替换抑制了野生型酶中观察到的多通道模型，导致整体同位素效应降低了约2.1倍。

pH对酶活性的影响与生物技术应用潜力

研究进一步比较了三种酶在pH 4.5–8.3范围内的活性谱。结果显示，GadB_D86N-H465A在pH > 7时仍保留活性，而野生型酶在此条件下已无活性，GadB_H465A的活性也极低。具体而言，双突变体在pH 7.0和8.0时分别保留了起始活性的10%和6%。在pH 7.0条件下进行的3小时反应时间进程分析表明，GadB_D86N-H465A能将96%的L-谷氨酸转化为GABA，而GadB_H465A仅转化了35%，野生型酶则不足1%。反应过程中溶液pH的监测显示，双突变体对pH升高的敏感性显著降低，这使其能够实现L-谷氨酸的近乎完全转化。

讨论与作用机制阐释

综合上述发现，研究对Asp86在GadB催化机制中的作用提出了新的见解。基于已知的反应模型（包括底物结合、转醛亚胺化、脱羧、醌型中间体质子化、产物转醛亚胺化及释放），研究对动力学同位素效应数据进行了深入解读。

对于^D₂Ok_cat/K_M，野生型酶约为1.7，双突变体约为2.12，表明Asp86在酸性pH下并不参与底物的重定向或构象变化步骤。对于巨大的^D₂Ok_cat效应，研究认为它反映了对k_cat有贡献的多个步骤中发生的质子转移，包括脱羧后步骤中与产物释放相关的质子转移。双突变体中该效应的显著降低，表明Asp86对野生型GadB中观察到的高SKIE有重要贡献，很可能通过影响涉及底物锚定和产物释放的氢键网络来实现。

研究指出，Asp86与L-谷氨酸γ-羧酸根基团的非最优初始相互作用可能解释了其在酸性pH下较高的K_M值。然而，一旦结合，底物可能处于更有利于后续反应步骤的位置（即更高的k_cat）。此外，His465似乎既不参与L-谷氨酸的结合，也不参与任何催化步骤，包括脱羧和产物释放。

结论与展望

本研究通过表征GadB_D86N-H465A双突变体，证实Asp86是野生型EcGadB中高溶剂动力学同位素效应的一个意外贡献者，可能通过影响氢键介导的底物结合和产物释放来实现。这一发现深化了对细菌谷氨酸脱羧酶精细催化机制的理解。

更重要的是，GadB_D86N-H465A变体在宽pH范围（延伸至pH > 8.0）内均能催化脱羧反应的能力，使其在生物技术应用中展现出巨大潜力。L-谷氨酸作为一种丰富的可再生资源，是工业化学生物合成GABA及其类似物（如2-吡咯烷酮前体）的理想底物。传统GadB的应用受限于其狭窄的酸性最适pH范围，而双突变体对pH升高敏感性的降低，使得反应pH不再成为限制参数，为开发更高效的基于生物法的GABA合成工艺提供了新的酶工具。同时，鉴于EcGadB已显示出对多种L-谷氨酸类似物的脱羧能力，该双突变体亦有望用于改进这些高附加值化合物的酶法合成。