《Chemical & Biomedical Imaging》：Surface Plasmon Resonance Imaging and Microscopy Modalities for Information-Rich, Label-Free Analysis of Biomolecular Interactions and Disease Biomarkers
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本文系统综述了表面等离子体共振成像(SPRi)和表面等离子体共振显微技术(SPRM)这两种无标记光学分析平台的最新进展。重点阐述了其在光学构型创新、机器学习辅助数据分析、纳米结构与生物膜表征以及疾病生物标志物检测方面的突破。综述突出了它们在分子识别、单粒子/单事件分析、癌症、自身免疫病和炎症等多种疾病标志物的高灵敏度、高通量检测应用中的潜力与前景。
近年来，表面等离子体共振(SPR)成像及其衍生的显微技术已发展成为对生物分子相互作用和纳米尺度物体进行实时、无标记分析的关键工具。表面等离子体共振成像(SPRi)通过电荷耦合器件(CCD)同时探测整个传感表面，实现了高通量、多重化的空间分辨检测。与其密切相关的表面等离子体共振显微镜(SPRM)则利用高数值孔径物镜耦合光并直接成像，提供了增强的空间分辨率和更深的传感深度，能够实现对单粒子和单事件的测量。这些技术的结合促进了从分子识别、定量相互作用分析、细胞外囊泡检测到纳米气泡表征的广泛应用。
2. 表面等离子体成像技术概览
多种表面等离子体共振成像技术被开发出来，其根本区别在于产生图像的光学构型。最常见的类型是棱镜耦合SPR成像，其原理通常基于Kretschmann结构，在连续金属薄膜上激发传播的表面等离子体，并对反射强度进行宽场成像。而SPR显微镜或物镜耦合SPR则使用高NA物镜来耦合光到表面等离子体，通常获得比棱镜SPRi更高的空间分辨率。此外，还存在一些其他与等离子体成像相关的方法，例如等离子体散射显微镜(PSM)、干涉等离子体成像(iSPR或等离子体干涉测量)、局域SPR(LSPR)成像、表面增强拉曼散射(SERS)成像、近场等离子体成像以及波导耦合等离子体成像。
2.1. 角度分辨SPRi
角度分辨SPR成像能够在单次测量中获取一系列入射角下的反射率图像。通过系统地扫描表面等离子体共振条件下的激发角度，可以为每个像素或感兴趣区域重建完整的角向反射率曲线。使用s偏振光作为内部参考来归一化p偏振响应，可以提升数据维度并增强对复杂表面特性的敏感性，但其带来的数据量增加和图像复杂性往往需要先进的后处理和建模算法来准确提取定量信息。
2.2. 多波长SPRi
多波长SPR成像在固定入射角下改变激发波长。相对于单波长强度型SPRi，多波长SPRi能够通过全彩色成像可视化共振位移，提供直观的光谱对比，并扩展了相对固定波长反射率测量的动态范围。
2.3. 相移SPRi
除了强度检测，Kretschmann构型中的SPR成像可以经过修改来监测入射光与反射光之间的相位变化。基于相位的SPRi通常比传统的强度型SPRi提供更高的固有分辨率，但其实际灵敏度可能因对背景噪声和环境波动的敏感性增加而受限。一项研究通过多通道相位敏感SPR成像平台实现了3.7 × 10–3RIU的动态检测范围和14.02 ng/mL的次级抗体结合检测限(LOD)。
2.4. SPRM及其改进
表面等离子体共振显微镜通过使用高数值孔径显微镜物镜而非棱镜来实现全内反射并激发表面等离子体。SPRM系统通常可以实现比传统SPR成像更高的空间分辨率和灵敏度。最近的进展集中在光学设计和信号处理的改进上。例如，全内反射SPR显微镜(TIR-SPRM)已被证明是一种通过结合TIR激发与傅里叶域重建来提高空间分辨率的方法。太赫兹显微镜也与SPRM原理相结合形成了太赫兹SPR平台，它采用Otto构型而非Kretschmann结构实现等离子体激发。
2.5. 干涉等离子体显微镜、等离子体散射显微镜和波导耦合等离子体成像
这些迭代技术建立在SPRi和SPRM的核心原理之上，在灵敏度、分辨率以及提取补充信息方面提供改进。干涉等离子体显微镜利用共路干涉术，通过表面等离子体与表面纳米结构的近场散射相互作用产生的干涉来成像。而等离子体散射显微镜则利用散射光而非反射光，显著提高了对比度，实现了更高的亮度和改进的时空分辨率。波导耦合SPR利用金属-介电质-金属表面构型而非传统SPR中的金属-介电质构型，通常带来比常规SPR更高的灵敏度和更锐利的反射率曲线。
3. 等离子体成像数据分析的新策略
3.1. 用于改进数据拟合的数学模型
常见的SPR成像数据清理方法依赖于数学模型。广泛使用的策略包括使用S型或非对称模型等解析函数拟合反射率曲线、基于质心的算法估算共振条件、或使用多项式拟合生成传感图的简化表示。更先进的建模方法，如偏最小二乘判别分析(PLS-DA)，可以将分析靶向到对应于已知结合事件的传感图特定区域，从而实现分子相互作用的预测性识别。
3.2. 机器学习在等离子体成像中的应用
将机器学习整合到SPR成像中，已成为改进复杂介质中的方法开发、系统模拟和分析物辨别的重要手段。例如，在神经网络的实现中，原始传感图数据可以被输入到输入层，而加权的统计描述符则被纳入隐藏层以建立数据点之间的相对关系。一个例子是将机器学习应用于开发多发性硬化症(MS)检测传感器，其中PCA分析和kNN分类器被用于基于对神经节苷脂阵列的整体响应来可靠地确定抗体身份。
深度学习处理还被用于承担专门的SPRM自动对焦设备的角色。此外，上下文聚合网络(CAN)等模型训练于菲涅耳模拟数据，可以从SPRM后焦平面图像中提取相位和反射率轮廓。
3.3. 改善SPR成像实验结果的计算机建模
计算建模在SPR成像实验平台的理性设计和优化中扮演关键角色。例如，菲涅耳方程模拟促进了对替代等离子体材料（特别是铝）的探索，并支持新型传感器芯片的开发和已建立表面设计的微调。计算加速的后数据采集分析可以进一步增强新型SPR成像平台的开发，例如通过机器学习方法跟踪多个波长的反射率最小值，从而为后续固定波长实验高效识别最具信息量的入射波长。
4. 纳米结构的等离子体成像表征：纳米颗粒、囊泡和液滴
4.1. 纳米颗粒
由于金银纳米颗粒固有的等离子体特性，可以使用SPRi，特别是SPRM进行高灵敏度表征。研究利用固定角度强度型SPRi表征了金和银纳米颗粒与血液蛋白以及具有不同脂质组成的膜模拟表面的结合相互作用。此外，SPRM已被证明能够高保真地检测从约100 nm到15 μm的各种生物细胞外囊泡(EVs)和非生物纳米颗粒。
4.2. 脂质囊泡
SPR成像分析在脂质动力学和囊泡形成研究中变得日益重要。一项名为动态单tEV表面蛋白谱分析免疫分析法(DISEP)的方法，利用时间分辨的单个囊泡结合事件来区分适配体标记的EV和未标记的EV，并以93%的准确率区分患病患者样本与健康对照。
4.3. 仿生膜
仿生膜模型是研究膜相关相互作用的宝贵工具。一个研究团队结合荧光标记的LigandTracer技术和表面等离子体共振显微镜，比较了配体结合动力学在活细胞、化学固定细胞和合成膜模拟物之间的差异。SPRi也被用于表征新兴的仿生纳米结构，包括DNA纳米组装体。一项研究使用SPRi研究了一种被称为HCR-Apt的DNA纳米组装体与β-淀粉样蛋白物种的结合相互作用。SPR成像也已扩展到膜渗透性的定量测量。
4.4. 纳米气泡
等离子体成像研究的一个新兴领域是纳米气泡的研究。多项研究利用表面等离子体共振显微镜来表征在常规技术难以接近的条件下纳米气泡的形成和动力学。一项研究考察了离子强度和pH值对纳米气泡溶解的影响，量化了气泡衰减速率。另一项研究则结合SPR成像、原子力显微镜测量和分子动力学模拟，专注于氢析出反应早期阶段的纳米气泡成核和生长，证明了纳米气泡通过“钉扎-上升”机制生长。
4.5. 气溶胶液滴
SPRM已显示出研究气态和水性环境污染物的潜力。2023年的一项研究报道，可以使用带有方位角旋转照明的SPRM在空气中检测超细气溶胶液滴。尽管SPRM/SPRi在环境科学中的应用仍然有限，但这些研究表明等离子体成像技术能够检测和监测化学相关的气溶胶成分。
5. 等离子体成像用于疾病生物标志物评估
5.1. 肿瘤学生物标志物
SPR成像技术已应用于量化从纳摩尔到皮摩尔浓度的分析物，其多孔或阵列式等离子体芯片进一步实现了多目标和样品的高通量并行分析。最近的研究特别关注与肿瘤疾病、自身免疫性疾病、炎症反应和传染病相关的生物标志物。例如，一项研究使用基于SPRi的生物传感器检测过表达人表皮生长因子受体2(HER2)的细胞。另一项工作采用DNA适配体作为捕获配体来量化人血清中的可溶性程序性死亡配体1(sPD-L1)，并通过引入偶联金纳米颗粒的抗sPD-L1抗体实现信号放大，获得了皮摩尔级的灵敏度。其他肿瘤和转移相关生物标志物，如成纤维细胞生长因子23(FGF23)、蛋白酶体和免疫蛋白酶体、钙黏蛋白12(CDH12)等，也已在复杂生物基质中使用SPRi进行了量化。前列腺癌的多重SPRi检测通过同时检测前列腺特异性抗原(PSA)以及其他三种抗原（胰岛素样生长因子1、血管内皮生长因子D、分化簇14），创建了能够抵抗来自良性前列腺增生和前列腺炎假阳性的检测方法。
5.2. 自身免疫性疾病
SPR成像固有的多重检测能力使其成为自身免疫病研究中对抗原-抗体相互作用进行分类的强大平台。例如，针对多发性硬化症(MS)，研究引入了固定角度SPR成像方法来定量探测固定在近超疏水传感器表面的神经节苷脂与加入人血清的MS相关抗体之间的相互作用。为了进一步解决基于血清测量的复杂性，该研究团队随后将SPRi与机器学习辅助分析相结合，使用k最近邻分类和神经网络来区分多种神经节苷脂物种与单个抗体之间的结合相互作用。这一SPRi-ML框架能够在1–100 ng/L的工作浓度范围内进行定量区分，并在全人血清中实现了低检测限。其他基于SPRi的研究专注于复发缓解型多发性硬化症的诊断生物标志物组，通过SPRi直接定量从100名RRMS患者和46名健康对照者血清中收集的泛素羧基末端水解酶L1(UCHL1)、瘦素和纤连蛋白。此外，纤连蛋白也作为膀胱癌的血清生物标志物被研究，过渡性细胞癌患者血清中层粘连蛋白-5、纤连蛋白和胶原蛋白IV的水平相对于健康人群升高。
5.3. 炎症
表面等离子体共振成像技术也越来越多地被应用于表征炎症和抗炎相互作用。例如，辉瑞研究人员使用SPRM来补充他们对结合趋化因子受体样2(CCRL2)的脂质配体的研究。SPRM被用来量化表达CCRL2的细胞与配体之间的结合动力学。
