共振拉曼光谱与密度泛函理论揭示鱼类和哺乳动物血红蛋白的血红素释放机制

《Journal of Agricultural and Food Chemistry》：Resonance Raman Spectroscopy and Density Functional Theory Reveal the Hemin Release Mechanism of Fish and Mammalian Hemoglobin

本研究巧妙地结合共振拉曼光谱（rR）、电子吸收光谱（EA）和密度泛函理论（DFT）计算，深入探究了鲑鳟鱼（鳟鱼IV型）与牛血红蛋白（Hb）在血红素（hemin）释放机制上的关键差异。文章揭示，在死后肌肉的低pH环境中，鳟鱼IV型Hb的远端组氨酸（HisE7）更易质子化并发生构象改变，导致其与轴向水配体的氢键网络减弱，这是其血红素解离倾向远高于哺乳动物Hb、并因此具有更强促氧化能力的主要驱动力。同时，研究还发现鳟鱼Hb四聚体结构更不稳定，存在更多低自旋（LS）的双组氨酸（bis-His）配位物种，这可能反映了其氧化诱导的四聚体解离早期阶段。这些发现为理解水产肉类（尤其是鲑鳟鱼类）在贮藏过程中因脂质和蛋白质氧化导致的品质劣变提供了重要的分子机制见解。

　　

引言

鲑鳟鱼类（如鳟鱼和鲑鱼）的肌肉是优质蛋白质和长链多不饱和脂肪酸（如EPA、DHA）的重要来源，具有巨大的市场价值和发展前景。然而，其高含量的不饱和脂肪酸也使得肌肉在宰后极易发生脂质和蛋白质氧化，导致异味、变色等感官品质劣变。血红蛋白（Hb）是驱动这些降解过程的关键因素之一。尽管加工中会尽力放血，但残留在肌肉毛细血管中的红细胞无法完全去除。宰后组织环境的变化（如pH下降、渗透压改变、冻融）会导致红细胞破裂，释放出具有促氧化作用的Hb。与牛Hb相比，鳟鱼Hb在宰后肌肉环境中释放血红素（ferric heme）的倾向性要强得多，而血红素释放是启动脂质氧化途径的关键步骤。然而，关于鳟鱼Hb血红素释放增强的确切机制尚不清楚。远端组氨酸（HisE7）和近端组氨酸（HisF8）的活性被认为是调控血红素释放的部分原因。本研究旨在利用共振拉曼光谱（rR）、电子吸收光谱（EA）和密度泛函理论（DFT）计算，探究鳟鱼IV型Hb与牛Hb在远端和近端血红素口袋结构上的差异，以阐明其促氧化能力差异的分子基础。

材料与方法

血红蛋白的分离与氧化

牛和虹鳟鱼（Oncorhynchus mykiss）的Hb从屠宰当天采集的血液中分离。分离出的Hb主要为氧合（Fe²⁺）状态，通过加入三倍于血红素摩尔浓度的铁氰化钾将其氧化为高铁血红蛋白（metHb， Fe³⁺）。鳟鱼血溶物需要进一步纯化以分离Hb同工型IV（鳟鱼IV型Hb，约占血溶物的65%）。

高铁血红蛋白-氟化物饱和度

将metHb稀释于pH 6.0的磷酸盐缓冲液中，暴露于不同浓度的氟化钠（NaF），并立即通过电子吸收光谱（EA）分析。通过绘制metHb-F复合物的分数与[NaF]的关系图，并用Hill方程拟合，计算饱和度曲线。

共振拉曼光谱

对于rR实验，血红素浓度为200 μM，因此根据饱和度实验将[NaF]增至360 mM。数据在pH 5.3和7.0下收集，选择此pH范围是为了捕获不同质子化状态的HisE7，其中低值（5.3）略低于牛肉（~5.5）和鳟鱼（~6.1）骨骼肌的宰后pH。样品在液氮中滴冻成珠。使用514.5 nm或457.9 nm的激光激发波长，在77 K下收集rR光谱。冰峰（228 cm^-1）用作内标。

计算模型

采用密度泛函理论（DFT）计算来补充光谱数据。初始原子坐标来源于牛metHb的高分辨率晶体结构（PDB ID：2QSP）。血红素环被截断，丙酸基被甲基取代，并在轴向位置放置氟原子。为了探究远端组氨酸质子化对Fe-F键性质的影响，考虑了三种不同模型：（1）中性远端咪唑，质子位于N_ε（HSE）；（2）中性远端咪唑，质子位于N_δ（HSD）；（3）带正电的远端咪唑，质子在N_ε和N_δ上（HSP）。此外，还评估了高自旋（HS）和低自旋（LS）的截短三价铁血红素模型。

频率与TDDFT计算

在几何优化之后，进行频率计算以模拟拉曼光谱。使用含Tamm-Dancoff近似的时变密度泛函理论（TDDFT）方法计算电子跃迁能和吸收强度。

结果

远端组氨酸质子化状态的探究

为了确定鳟鱼IV型和牛三价铁Hb在宰后pH（5.3）和近生理pH（7.0）下远端组氨酸的质子化状态，研究使用氟离子作为对氢键敏感的探针，并通过rR光谱在两种pH下识别铁-氟拉伸频率（νFe-F）。NaF滴定结果显示，牛和鳟鱼IV型Hb的饱和浓度分别为134.4 mM和135 mM。在rR实验中，NaF浓度提高至360 mM。

室温电子吸收光谱显示，当pH从7.0降至5.3时，鳟鱼IV型metHb-F的最低能量电荷转移（CT1）带发生显著红移（+7 nm），而牛metHb-F的红移较小（+3 nm）。CT1的红移可归因于远端残基向氟配体氢键捐赠的增加。进一步的pH滴定表明，鳟鱼IV型metHb-F在pH 6.4时即发生显著的CT1位移，而牛metHb-F直到pH 5.8才出现等效位移。这首次表明鳟鱼IV型Hb远端组氨酸具有更高的pK_a。

通过rR光谱在77 K下进一步分析证实了这一点。在pH 7.0时，鳟鱼IV型和牛metHb-F的νFe-F值分别为471和470 cm^-1，表明此时两者的氢键捐赠强度相同。然而，在pH 5.3时，仅在鳟鱼IV型metHb-F中观察到一个宽峰（~428-433 cm^-1），这被初步认定为低pH下的νFe-F。这一信号仅出现在鳟鱼IV型样品中，且峰宽增加，可能反映了metHb-F物种的异质性种群。

为了确认~430 cm^-1处的峰确实是氟结合的结果，研究还收集了不含NaF的aquometHb样品的rR光谱，在该位置未观察到峰。

DFT计算验证

DFT计算证实，增加氢键捐赠（远端His对F^-）会导致νFe-F降低。计算了三种高自旋metHb-F模型（HSD、HSE、HSP）。随着氢键捐赠增加（HSD < HSE < HSP，以F-H_ε1距离减小为度量），Fe-F键长增加，近端N_ε-Fe键长减小，核心尺寸（R_Ct-N）减小。频率计算支持这一假设，HSD、HSE和HSP模型的νFe-F计算值分别为504.3 cm^-1、445.8 cm^-1和388.2 cm^-1。通常，随着氢键捐赠增加，Fe-F拉伸运动与其他模式的混合变得更加明显。

鳟鱼IV型高铁血红蛋白中的低自旋物种

在肌肉食品更相关的生物学状态下，研究还表征了三价铁Hb的水合形式（aquometHb）。与牛metHb相比，鳟鱼IV型metHb在pH 5、6和7下显示出独特的EA光谱，最明显的是CT2、低自旋（LS）和CT3跃迁的不同。这些光谱差异很可能由鳟鱼IV型metHb中LS三价铁血红素种群增加引起。根据已有研究，这种LS物种可能源于双组氨酸轴向配位，而不是HO^-配体的存在。TDDFT计算的HS和LS血红素模型光谱支持了这一观点：LS模型光谱中有一个强峰位于HS模型的CT2和CT3吸收带之间，这会导致混合种群中CT2和CT3峰的展宽，正如实验光谱所观察到的。此外，计算光谱显示从HS模型到LS模型，Soret带发生红移。与计算数据一致，在所有测试pH下，鳟鱼IV型metHb的Soret峰在实验光谱中红移了60-120 cm^-1。这一Soret红移进一步暗示了LS、双组氨酸种群的存在。

近端组氨酸-铁键的考察

除了远端口袋的组氨酸，近端组氨酸（Fe-N_prox键合相互作用）在血红素释放中也起着重要作用。晶体结构显示，在pH 5.7时，鳟鱼IV型metHb的平均Fe-N_prox距离为2.11 ?，而牛metHb为2.08 ?。鉴于这一差异，预计鳟鱼IV型metHb的νFe-N_prox会因键长更长而向低能方向移动。为了通过rR光谱检测Fe-N_prox键强度，需要高血红素浓度并防止冰晶形成。尽管采取了相应措施，但在鳟鱼IV型或牛metHb的rR光谱中均未检测到低能量的νFe-N_prox。

讨论

已有大量证据证实鳟鱼IV型Hb与哺乳动物Hb相比，具有更高的自动氧化、血红素释放和脂质过氧化能力。本研究的数据为解释这些差异提供了一个框架。

第一个重要发现是鳟鱼IV型metHb的远端组氨酸具有比牛metHb更高的pK_a。这一更高pK_a的一个驱动力是其邻近的αTrpCE4（牛Hb中为αPheCE4），它在HisE7质子化后可形成更稳定的π-阳离子相互作用。另一个驱动力是牛Hb中带正电荷的LysE10被鳟鱼IV型Hb中的ThrE10所取代。LysE10位于HisE7的5 ?范围内，会更倾向于HisE7的HSE/HSD形式以最小化静电排斥，从而降低牛Hb的pK_a。基于rR和计算数据，在高pH下，牛和鳟鱼IV型Hb的远端组氨酸很可能都处于HSE形式。在低pH（5.3）下，特别是在鳟鱼IV型Hb中，远端组氨酸被认为处于其HSP质子化状态。低pH下νFe-F峰的变宽（47 cm^-1vs 高pH下的30 cm^-1）归因于metHb-F种群的异质性。检查鳟鱼IV型Hb晶体结构发现，α链和β链的血红素丙酸酯与质子化远端组氨酸之间可能存在不同的氢键网络，这可能导致在低pH下形成多种metHb-F种群。

第二个重要发现是鳟鱼IV型metHb中存在更大的LS血红素种群。实验上，这通过EA光谱中Soret带红移、CT跃迁展宽以及LS/HS血红素物种比例升高得以证明。计算上，观察到Soret峰红移以及HS EA光谱的CT区域内存在LS跃迁，这可能导致实验峰的展宽。在促氧化能力更强的鳟鱼IV型metHb中LS物种比例增加是出乎意料的，因为LS物种通常显示较低的氧化剂活化能力。先前研究表明，Hb的分离β链在pH 5-7之间含有显著的LS血红素物种，该物种被鉴定为双组氨酸配位的三价铁血红素，是在Hb α-β界面接触被破坏后形成的。基于氢键供体和受体之间的距离，鳟鱼IV型Hb在α-β四聚体界面形成的氢键网络比牛Hb更弱。因此，鳟鱼IV型Hb四聚体可能更容易在氧化诱导的四聚体解离途径中形成双组氨酸。四聚体结构的破坏可能产生重大的促氧化和功能后果：分离的单体显示血红素解离显著增加；单个Hb亚基对脂质膜的亲和力比四聚体更高；在某些情况下，双组氨酸的形成是蛋白质聚集的前提。因此，尽管在鳟鱼IV型metHb中出现了意料之外的LS种群，但这种LS血红素种群可能反映了氧化诱导的四聚体不稳定性及其早期解离阶段。

本研究的数据引出了一个关于鳟鱼IV型metHb促氧化能力的工作模型。数据表明，鳟鱼IV型Hb的远端组氨酸具有更高的pK_a，在质子化后，特别是在α链中，可以摆向CE-turn，与TrpCE4形成强烈的阳离子-π相互作用，实质上“打开了”血红素裂隙的门。已有充分证据表明，当远端E7残基与配位配体之间的氢键被移除时，水占有率会下降，血红素损失可能增加10倍以上。与此同时，鳟鱼IV型Hb整体结构的不稳定性促进了双组氨酸的形成和解离。

总而言之，这项研究揭示了鳟鱼IV型血红蛋白在宰后低pH条件下，其远端组氨酸更易质子化并改变构象，导致血红素口袋“打开”，以及其四聚体结构不稳定易于解离，是导致其血红素释放倾向和促氧化能力远高于牛血红蛋白的关键分子机制。这为理解水产肉类，特别是富含血红蛋白的鲑鳟鱼类，在加工贮藏过程中易发生脂质氧化和品质劣变的现象提供了重要的理论依据。