《Journal of Agricultural and Food Chemistry》：Potential of Quantitative α-Amylase or Trypsin Inhibition by Refined and Whole Wheat and Einkorn Using High-Performance Thin-Layer Chromatography–NanoGIT versus Conventional Spectrophotometry
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这篇综述介绍了评估谷物中α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂（ATIs）活性的新方法——HPTLC-nanoGIT联用技术。该技术克服了传统分光光度法难以将抑制作用与特定抑制剂关联的局限，能在同一表面上实现抑制定量及代谢产物分析，为研究ATIs与非腹腔麸质敏感（NCWS）等健康问题的关联提供了更高效、信息更丰富的分析工具。
在谷物科学和食品安全领域，α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂（ATIs）作为谷物种子中天然存在的蛋白质，因其能够抑制人体分解碳水化合物和蛋白质的关键消化酶而受到广泛关注。ATIs约占小麦总蛋白的2-4%，目前已发现19种，以单体、二聚体或四聚体形式存在。研究表明，ATIs对消化健康有负面影响，可能引发胃肠道不适和炎症，并在多项研究中被讨论为非腹腔麸质敏感（NCWS）的潜在诱因。然而，当前分析ATIs的方法存在挑战，主要是抑制作用潜力与具体抑制剂之间缺乏直接关联。传统的分析方法主要有两类：一是使用串联质谱分析来鉴定和/或量化谷物产品中已知ATIs的含量；二是应用分光光度法来分析作为总和值的抑制作用。这两种技术的共同点是识别抑制潜力或量化已知抑制剂，但未能直接将观察到的抑制作用与特定抑制剂联系起来，且两者结合使用的情况非常罕见，主要是因为其巨大的工作量和成本。
为解决这一问题，本研究提出并开发了两种新型的“表面上”检测方法（nanoGIT），用于量化精制小麦、全麦和单粒小麦（einkorn）面粉提取物对α-淀粉酶和胰蛋白酶的抑制作用，并随后通过高效能薄层色谱（HPTLC）在同一表面上直接分析代谢产物。这项研究旨在简化和改进先前开发的HPTLC筛选方法，并验证整个工作流程可以完全在表面上一步完成（HPTLC-nanoGIT），且能够对ATIs的抑制进行定量分析，从而为评估抑制剂提供一种优于脆弱的分光光度法的替代方案。
在材料与方法部分，研究详细描述了所用的化学品、面粉样品（购自本地超市的精制小麦405型、有机全麦和单粒小麦）、ATIs的提取及糖类的去除流程。关键的实验方法包括：
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HPTLC-NanoGIT（淀粉酶抑制）-荧光/可见光检测法：将阳性对照阿卡波糖和纯化后的面粉提取物点样于HPTLC板上，与纯化的α-淀粉酶和可溶性淀粉共同孵育进行淀粉酶解。通过衍生化试剂序列（先后使用对氨基苯甲酸试剂和2-萘酚试剂）进行检测，分别对释放的单糖和寡糖进行高灵敏检测和定量。
- 2.
用于比对的淀粉酶抑制分光光度法：使用碘/碘化物试剂，通过测量淀粉-碘复合物的吸光度来评估淀粉酶解被抑制的程度。
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HPTLC-NanoGIT（蛋白酶抑制）-可见光检测法：将胰蛋白酶、抑制剂（阳性对照大豆胰蛋白酶抑制剂或面粉提取物）和底物酪蛋白依次施加于HPTLC板同一区域，进行表面上蛋白酶解抑制反应，随后展开分离并使用茚三酮试剂衍生化检测肽段。
结果与讨论部分展示了丰富的数据和比较：
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淀粉酶抑制分析的比较与开发：研究首先验证了传统的分光光度法（碘/碘化物法）能够检测面粉提取物的淀粉酶抑制潜力。随后，成功开发了全流程在表面上一步完成的HPTLC-nanoGIT（淀粉酶抑制）方法。该方法通过优化孵育时间、采用单步孵育策略以及使用高灵敏的衍生化试剂序列，显著提高了分析效率和信息量。研究还发现，需要通过对α-淀粉酶和面粉提取物进行透析（12小时）以去除其中固有的单糖和寡糖，从而减少背景干扰，获得更准确的结果。
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定量评估面粉提取物的淀粉酶抑制：应用建立的HPTLC-nanoGIT（淀粉酶抑制）方法对三种纯化面粉提取物进行定量分析。结果显示，单粒小麦提取物对α-淀粉酶的抑制程度低于精制小麦或全麦，而精制小麦和全麦之间则未显示出差异。该方法不仅能够量化总体抑制率，还能解析出淀粉酶解释放的葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖等特定产物的变化情况，揭示了不同谷物提取物可能存在的不同抑制模式。
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胰蛋白酶抑制分析：传统的分光光度法（使用L-BAPA底物）显示，在高提取物浓度下，三种谷物类型均能达到近100%的胰蛋白酶抑制率。然而，新开发的HPTLC-nanoGIT（蛋白酶抑制）方法仅部分确认了这一结果。该方法虽然能够观察到蛋白酶解的抑制现象，并比较不同谷物提取物的抑制差异（例如，单粒小麦在某些肽段信号上表现出更强的抑制），但由于面粉提取物本身含有大量内源性肽段，产生了强烈的背景信号，给定量评估带来了挑战。研究发现，分光光度法在低提取物体积下甚至出现了“负抑制”（即表观酶活性增加）的异常现象，其原因尚不明确。
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方法学比较：研究对开发的HPTLC-nanoGIT工作流程与传统分光光度法进行了全面比较。对于淀粉酶抑制分析，HPTLC-nanoGIT方法所需的底物和抑制剂更少，效率更高，同时能提供传统方法无法获得的、关于单个糖类释放及其相互作用的详细信息。对于胰蛋白酶抑制分析，HPTLC-nanoGIT方法实现了在表面上一步完成检测的设想，但由于基质干扰，目前更适合进行定性或半定量比较。分光光度法所报告的高浓度下100%的抑制率，在HPTLC-nanoGIT平台上未能完全重现。
结论指出，本研究首次成功建立了两种表面上检测方法（HPTLC-nanoGIT），作为现有分光光度法抑制剂检测的可靠乃至更优的替代方案，两者可以互补使用以更好地评估ATIs的抑制潜力。与质谱方法相比，HPTLC-nanoGIT方法不仅能用于鉴定已知抑制剂，结合进一步的纯化和效应导向分析，还有潜力识别未知的抑制剂。这两种方法的强大之处在于，它们提供了释放的单个代谢产物的谱图模式，并比较了不同抑制剂下的这些模式，从而识别出不同抑制剂可能存在的不同抑制机制。相比传统方法，HPTLC-nanoGIT获得了更多信息，这对于理解与非腹腔麸质敏感（NCWS）、其诱因及酶相互作用相关的基础机制至关重要。为了降低入门成本，经济实惠的2LabsToGo系统可用于应用这种信息更丰富、更可持续的表面上方法学。
