《Journal of Agricultural and Food Chemistry》：The Entomotoxic Fungal Lectin Marasmius oreades Agglutinin Disrupts the Midgut Epithelium of Colorado Potato Beetle Larvae
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本文系统评估了六种真菌凝集素对科罗拉多马铃薯甲虫（CPB）幼虫的杀虫潜力，发现源自真菌Marasmius oreades的凝集素（MOA）具有最强致死效果。研究通过突变体等功能分析，揭示了MOA的毒性依赖于其糖结合域和蛋白酶域的协同作用，并首次在CPB中肠内鉴定出其关键糖蛋白靶点。组织学和超微结构观察证实，MOA能破坏中肠上皮细胞极性和基底膜连接，导致细胞脱落死亡。值得关注的是，MOA对欧洲蜜蜂成虫无急性毒性，显示了其作为靶向性生物杀虫剂的应用前景。该研究为开发基于真菌凝集素的新型、可持续害虫控制策略提供了重要见解。
摘要
植物通过产生特定蛋白来应对植食性昆虫的攻击，这些蛋白靶向昆虫消化系统，破坏其营养吸收、酶活和肠道完整性。然而，昆虫常通过代谢适应来克服植物的防御。化学杀虫剂的使用成本高且破坏环境，因此需要更可持续的天然选择。昆虫毒蛋白不仅可由植物产生，真菌也是其丰富来源。真菌凝集素凭借其特异的糖结合活性，成为有潜力的生物杀虫剂候选物。
本研究调查了六种真菌凝集素——Marasmius oreadesagglutinin (MOA)、Aleuria aurantialectin (AAL)、Coprinopsis cinereagalectin 2 (CGL2)和galectin 3 (CGL3)、Coprinopsis cinerealectin 2 (CCL2)以及Cocaprin 1 (CCP1)——控制科罗拉多马铃薯甲虫（Leptinotarsa decemlineata， CPB）幼虫的潜力。通过离体喂养试验评估重组凝集素的个体毒性，发现MOA造成的死亡率显著高于其他凝集素，而CCL2和AAL则完全抑制了幼虫的体重增加。
材料与方法
研究团队采用细菌表达系统制备了重组真菌蛋白，并通过定点突变技术获得了MOA的几种突变体：缺乏蛋白水解活性的MOA C215A（可形成二聚体）、仅含糖结合域的单体MOA ΔC，以及缺乏糖结合活性但具有活性蛋白酶域的MOA Q46AW138A。
通过用处理过的马铃薯叶碟喂养CPB幼虫（L2-L3龄期）进行毒性生物测定，评估了存活率、摄食率和体重变化。为探究MOA的作用机制，还进行了表面等离子体共振（SPR）分析以检测其与CPB幼虫极性脂质的结合，并通过亲和色谱结合质谱法鉴定了MOA在中肠蛋白提取物中的潜在分子靶点。此外，利用组织学和透射电镜观察了MOA处理对幼虫中肠和后肠上皮结构的影响。同时，研究也评估了这些凝集素对欧洲蜜蜂（Apis mellifera）成虫和幼虫的潜在毒性，以考察其非靶标效应。
结果
真菌凝集素对CPB幼虫的毒性筛选
为期5天的生物测定结果显示，除CCL2外，所有测试的凝集素（MOA、AAL、CGL2、CGL3和CCP1）以及阳性对照杀虫剂spinosad均显著降低了CPB幼虫的存活率。其中，MOA造成的死亡率最高，其在第4天的死亡率比对照组高75%。MOA也表现出最强的拒食效果，摄食率约为对照组的六分之一。在体重变化方面，摄食经CCL2、AAL和MOA处理的叶片的幼虫均出现负增长，表明这些凝集素具有亚致死效应（饥饿及其他生理影响）。与基于苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensissubsp. tenebrionis）的商品化生物杀虫剂Novodor FC相比，MOA表现出更强的杀虫活性。
MOA的毒性与作用模式
MOA在浓度为2 mg/mL时，可在48小时内导致100%的幼虫死亡，其半致死浓度（LC50）为0.67 mg/mL。
糖结合与蛋白酶活性对MOA毒性的必要性
功能分析表明，MOA的毒性依赖于其糖结合域和蛋白酶域的协同作用。糖结合活性失活的突变体MOA Q46AW138A、去除C端蛋白酶域的突变体MOA ΔC，以及仅蛋白酶活性失活的突变体MOA C215A，其杀虫毒性均被有效消除。使用抑制性单糖甲基-α-D-半乳糖吡喃糖苷（Me-α-Gal）来模拟失活的糖结合突变体，并未能抑制MOA的毒性。
MOA结合CPB幼虫中肠的糖蛋白
研究未检测到MOA与CPB幼虫极性脂质提取物（可能含有糖脂）的结合。然而，通过分析糖苷酶处理后的中肠蛋白提取物，并比较野生型MOA与糖结合缺陷突变体MOA Q46AW138A的结合情况，证实了MOA能与中肠糖蛋白结合，且这种结合在PNGase F（去除N-糖链）和O-糖苷酶（去除O-糖链）处理后消失。
通过MOA亲和色谱和质谱分析，鉴定出多个潜在的MOA相互作用蛋白。其中最关键的潜在靶点是氨基肽酶（aminopeptidase），这是一种位于细胞膜的112 kDa糖蛋白，推测其可能介导MOA的内吞作用。此外，网格蛋白（clathrin）也被鉴定为潜在靶点，它位于质膜内侧，参与细胞蛋白质运输和网格蛋白介导的内吞作用，但网格蛋白本身不糖基化。其他被鉴定的蛋白还包括参与细胞代谢和应激反应的蛋白，如组织蛋白酶B、热休克蛋白70a、热休克蛋白83、热休克蛋白60 kDa、E1泛素激活酶等，这些可能是MOA蛋白酶活性的靶点。
MOA暴露导致中肠上皮结构紊乱和异常细胞积累
组织学观察显示，MOA处理24小时后，幼虫中肠上皮完全紊乱，失去正常的单层柱状上皮结构，细胞失去顶-基底极性，并出现多层排列，基底层有小细胞聚集，而上层细胞逐渐解体脱落至肠腔。相比之下，后肠上皮在处理组和对照组间未观察到明显结构差异。
超微结构分析进一步揭示了MOA的破坏性影响。在对照组中，中肠上皮细胞具有清晰的顶-基底极性：顶端有密集的微绒毛刷状缘，基底膜形成复杂的基底迷路，细胞间通过隔状连接和粘附连接紧密相连。而在MOA处理组中，细胞极性丧失，微绒毛变得短小、不规则，隔状连接的方向发生紊乱，基底迷路消失，基底板与基底质膜分离，并且缺乏半桥粒样连接。大量的细胞间空隙出现，细胞碎片充斥肠腔。
对蜜蜂的毒性生物测定
对成年蜜蜂和幼虫的急性口服毒性测试表明，在测试浓度下（1 mg/mL），所有测试的凝集素均未对成年蜜蜂的存活率或摄食率产生显著不利影响。根据OECD指南进行的极限测试确定，MOA对成年蜜蜂的LC50大于100 μg a.i./bee，表明其急性毒性较低。在幼虫测试中，凝集素处理未显著影响存活率，但MOA、CGL2和CCL2处理组的幼虫体重最低，尽管与阴性对照组相比差异不显著。
讨论
真菌凝集素通过其特异的糖结合活性发挥杀虫作用，而非普遍的细胞毒性，这使其成为理想的害虫特异性生物杀虫剂候选物。本研究表明，MOA对CPB幼虫具有最强的毒性效应。
MOA的作用机制涉及与中肠糖蛋白（特别是氨基肽酶）的结合，这可能导致其通过内吞作用进入细胞。这与之前在其他生物系统中的发现一致，例如M. procera凝集素（MpL）可通过与氨基肽酶N结合而被内吞。在哺乳动物细胞中，MOA可引起β1-整合素的内化和降解，破坏粘着斑信号传导，导致细胞骨架重组、细胞脱离和死亡。本研究在CPB幼虫中鉴定出肌动蛋白（actin）作为MOA的潜在靶点，进一步支持了其对细胞粘附结构的破坏作用。中肠上皮细胞的脱离和基底板分离，以及半桥粒样连接的缺失，均表明MOA损害了细胞与基底膜之间的整合素依赖性粘附。
MOA的破坏作用仅限于中肠，后肠由于腔面覆盖有甲壳素角质层，可能作为分子筛阻止了大分子（如MOA）的通过。
对蜜蜂的测试结果显示了MOA的选择性毒性，这可能源于CPB与蜜蜂之间糖基化谱（特别是N-糖组）以及肠道环境（如pH、离子组成、蛋白酶）的差异。这种选择性为其作为环境友好型杀虫剂的应用提供了重要优势。
总之，本研究证实了MOA作为一种高效的、选择性真菌凝集素生物杀虫剂，通过破坏CPB幼虫中肠上皮的完整性和极性发挥杀虫作用，同时对重要的非靶标昆虫蜜蜂表现出较低的急性毒性。这凸显了大型真菌作为选择性杀虫蛋白来源的巨大潜力，为开发可持续的害虫管理策略提供了新方向。
