《Journal of Medicinal Chemistry》：Development of PROTACs Targeting the Moonlighting Enzyme Nicotinamide Phosphoribosyltransferase (NAMPT) for Breast Cancer Therapy
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本文报道了针对“双面”（moonlighting）酶烟酰胺磷酸核糖基转移酶（NAMPT）的新型蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）的理性设计、合成与生物评价。研究以本组先前发现的强效NAMPT抑制剂MV78为靶点配体，通过系统性的构效关系（SAR）研究，发现移除连接子中的三唑环并在VHL配体上引入（S）-甲基可显著增强降解能力，最终获得优化的降解剂U42。该化合物在乳腺癌细胞系和三维（3D）肿瘤球模型中，展现出优异的NAMPT降解活性、抗增殖效果、良好的药代动力学特性及代谢稳定性，为开发可同时靶向NAMPT酶促与非酶促功能的乳腺癌治疗策略提供了有力的先导化合物和理论依据。
引言：靶向多功能“双面”酶NAMPT的挑战与机遇
烟酰胺磷酸核糖基转移酶（NAMPT）是一种典型的“双面”蛋白，具有多重功能。细胞内NAMPT（iNAMPT）是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）补救合成途径的限速酶，对癌细胞的快速增殖至关重要；而细胞外NAMPT（eNAMPT）则作为一种促炎、促肿瘤的细胞因子，在癌症进展中发挥作用。传统的小分子抑制剂（SMIs）主要阻断iNAMPT的酶活性，但无法有效干预eNAMPT的非酶功能，且临床开发常因剂量限制性毒性（如血小板减少症和心脏毒性）或疗效有限而受挫。因此，迫切需要能同时靶向iNAMPT和eNAMPT的新策略。蛋白降解技术，特别是蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC），通过泛素-蛋白酶体系统（UPS）催化性降解靶蛋白，为攻克多功能蛋白提供了新思路。
结果与讨论：从理性设计到优化降解剂U42的发现之旅
NAMPT靶向PROTAC的理性设计
本研究选用本组先前发现的强效NAMPT抑制剂MV78（IC50= 18.2 nM）作为靶点（POI）配体。基于分子对接模型，确定在其末端苯环的间位进行连接子连接。选取了两种广泛使用的E3连接酶配体：用于募集CRBN的来那度胺，以及用于募集von Hippel-Lindau（VHL）的羟脯氨酸配体。研究系统地评估了烷烃和聚乙二醇（PEG）两类不同长度和组成的连接子，并特别关注了通过点击化学引入的三唑环对降解效率的影响。
化学合成与先导化合物的生物学鉴定
合成了包含三唑环的CRBN基（U1-U13）和VHL基（U14-U21）PROTAC库。初步细胞活性筛选（MTT法）显示，多数化合物在10 μM浓度下能降低MCF7乳腺癌细胞活力超过50%，但Western blot分析表明，这些活性源于酶抑制而非蛋白降解。随后，合成了不含三唑环的VHL基和CRBN基PROTAC（U22-U41）。筛选发现，化合物U23和U31能够有效诱导NAMPT降解。其中，VHL基的U31在MCF7和4T1乳腺癌细胞中表现出更优的降解效力（DC50分别为107 nM和350 nM）和细胞毒性。
先导化合物的验证与优化
机制验证表明，U31介导的NAMPT降解可被蛋白酶体抑制剂硼替佐米阻断，证实其通过UPS发挥作用。为了提高VHL结合亲和力，在VHL配体的苄位引入了（S）-甲基，合成了甲基化衍生物U42。U42的降解效力得到显著提升，在MCF7和4T1细胞中的DC50分别达到45 nM和55 nM，抗增殖活性（IC50）也增强至110 nM和157 nM。通过无活性立体异构体对照（U42-NC）、竞争实验以及细胞热位移分析（CETSA）等一系列实验，证实了U42通过同时结合NAMPT和VHL形成三元复合物，从而特异性诱导NAMPT降解。
结构-活性关系（SAR）的关键发现：三唑环的“双刃剑”效应
一个关键的SAR发现是，连接子中是否含有三唑环对降解活性有决定性影响。对比结构高度相似但连接子含三唑的U14与不含三唑的U31，前者仅有酶抑制活性而无降解能力。分子动力学（MD）模拟为这一现象提供了机理解释：U14中的三唑环使连接子刚性过强，可能限制了与VHL E3连接酶的有效结合，从而无法稳定三元复合物；而U31的柔性连接子则允许更优的构象调整，促进稳定的蛋白-蛋白相互作用。
NAMPT降解对其胞外定位的影响
研究还评估了U42对eNAMPT水平的影响。短期处理（18小时）未观察到eNAMPT降低，反而有暂时性升高趋势。然而，采用延长处理方案（18小时处理+24小时血清饥饿培养）后，U42能够以剂量依赖方式有效降解eNAMPT（DC50≈ 50 nM）。这表明，eNAMPT的完全耗竭需要更长时间，可能因为需要先耗竭细胞内的eNAMPT前体池。
代谢稳定性与药代动力学（PK）特征
U42在体外（人/小鼠血浆、肝微粒体）表现出优异的代谢稳定性（60分钟后残留>90%）。小鼠体内药代动力学研究显示，U42具有可接受的半衰期（t1/2= 1.6 h）和暴露量。代谢产物分析表明，生物转化主要发生在连接子和MV78配体区域，而VHL配体和三唑部分保持稳定。
靶向NAMPT降解损害乳腺癌肿瘤球活力
在更接近体内三维结构的乳腺癌肿瘤球模型中评估了U42的疗效。单次给药后培养8天，U42能显著减少MCF7和4T1细胞形成的肿瘤球数量和大小。Western blot证实，在肿瘤球培养条件下，U42依然能有效降解iNAMPT。同时，培养上清中的eNAMPT水平也显著降低。这些结果证明了U42在破坏乳腺癌细胞致瘤潜能方面的效力。
结论：迈向乳腺癌治疗的新策略
本研究成功开发了一系列基于MV78抑制剂的NAMPT靶向PROTAC。通过系统的SAR研究，发现并阐释了连接子中三唑环对降解活性的负面影响，并最终优化出强效降解剂U42。U42不仅能有效降解iNAMPT和eNAMPT，降低细胞内NAD+水平，还具有优异的体外代谢稳定性、良好的药代动力学特征，并在三维肿瘤球模型中显示出抑制肿瘤生长的潜力。与以往基于FK866（含丙烯酰胺）或硫脲/脲类抑制剂的NAMPT降解剂相比，MV78（三唑吡啶衍生物）骨架可能提供更好的代谢稳定性和安全性。这些发现不仅确立了U42作为治疗乳腺癌的潜在先导化合物，也为开发能同时消除NAMPT酶功能和非酶功能的创新疗法奠定了坚实基础。未来工作将集中于开发肿瘤微环境激活型PROTAC，以提高治疗的选择性并降低系统性副作用。
