《Journal of Medicinal Chemistry》：Antiviral Profiling and Cellular Activation of Carbobicyclic Nucleoside Analogues
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本文评估了以新型碳双环骨架为核心的核苷类似物（NAs）作为广谱抗病毒候选药物的潜力。研究团队设计合成了一个结构多样的药物库，并系统评估了其对多种病毒（包括流感病毒、HCV、RSV等）的抗病毒活性与作用机制。关键发现包括：尿苷类似物 2a 能有效抑制IAV聚合酶（RdRp）活性；该骨架能高效在细胞内磷酸化为其三磷酸形式，且对宿主DNA/RNA聚合酶无显著抑制作用。这项工作为开发具有新作用机制的广谱抗病毒药物提供了有前景的先导骨架和合成平台。
引言与背景
核苷类似物（NAs）是抗病毒和抗癌药物的重要来源，在治疗人类免疫缺陷病毒（HIV）和乙型肝炎病毒（HBV）等慢性疾病方面取得了巨大成功。然而，针对流感病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）和呼吸道合胞病毒（RSV）等呼吸道病毒的NAs应用仍然有限。传统的核苷类似物结构多样性有限，修饰通常集中在碱基部分。碳环核苷类似物通过将核糖环上的氧原子替换为亚甲基，有望获得更高的代谢稳定性和合成设计的灵活性，但因其与核糖构象相比缺少异头碳稳定化作用而较少见。
本研究基于一种可模拟核糖构象、易于合成的新型碳双环骨架，构建了一个药物库，并系统评估了其广谱抗病毒效力、代谢特征和与宿主细胞的相互作用。
结果与讨论
1. 碳双环核苷类似物的汇聚式合成与药库构建
研究采用汇聚式合成策略，构建了一个包含修饰碱基和天然碱基的碳双环核苷类似物库，该库包括利巴韦林类似物、尿苷类似物等，并合成了受莫努匹韦、利巴韦林和5-氟尿嘧啶（5-FU）等已知抗病毒药物启发的多种类似物。合成通常从商业化底物出发，步骤少于10步，为系统评估提供了结构多样性基础。
2. 广谱抗病毒筛选识别出有前景的候选化合物
研究针对八个不同病毒科的病毒进行了抗病毒活性筛选，包括小核糖核酸病毒科、黄病毒科、副粘病毒科、冠状病毒科、正粘病毒科、肺病毒科、披膜病毒科和疱疹病毒科。结果显示，尿苷类似物2a对HCV、IAV (H1N1pdm)、寨卡病毒和HSV具有抗病毒活性，但其异构体2b和2c对HCV无活性甚至增强病毒复制。腺嘌呤类似物5c和6a对HPIV-3和HSV显示中等活性，但5c表现出显著的细胞毒性。总体而言，筛选发现了1b、2a、5c和6a等潜在先导骨架，为后续的结构-活性关系优化提供了方向。
3. 利巴韦林类似物1b在RSV模型中降低病毒载量但无细胞保护作用
在针对RSV的研究中发现，尽管1b在TCID50测定中能显著降低病毒载量（超过1000倍），但在细胞病变效应测定中未能提供细胞保护。这表明病毒载量的减少并不一定转化为可观察到的细胞保护，强调了在抗病毒药物发现中需要采用互补的检测策略。
4. 基于TCID50的IAV病毒载量降低并不能保证在CPE测定中的细胞保护
进一步以IAV为模型的研究验证了上述现象。化合物1b和利巴韦林在TCID50测定中能减少感染性病毒滴度，但这种病毒复制抑制并未转化为细胞保护效应。研究人员推测，IAV可激活多种细胞死亡途径，这些途径可能独立于病毒复制效率，从而缩小了抗病毒药物发挥保护作用的治疗窗口。
5. 针对甲型流感病毒抗病毒活性的构效关系研究
为优化抗病毒效力，研究人员合成了更多的嘧啶和嘌呤类似物并评估其对IAV的活性。
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嘧啶类似物（以2a为代表）：研究发现，C5′/C6′羟基的位置和立体化学具有一定灵活性，所有四种立体异构体2a-d都表现出相似的抗病毒谱，其中2a活性最高。然而，缺失羟基的5′-脱氧化合物2e完全失活。C3′氟取代类似物2g和假-2′-脱氧类似物2f不仅无活性，反而增强了CPE效应（即促病毒活性）。此外，尽管NHC和胞苷类似物（如3a、4a）带有已知的药效团，但均未显示显著抗病毒活性。这些结果表明，碳双环骨架显著改变了所连接碱基的生物活性谱。
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嘌呤类似物：嘌呤类似物对IAV的总体活性低于嘧啶类似物如2a。活性最高的化合物包括15b、5d、1a和16a。
6. 碳双环类似物2a干扰IAV聚合酶活性
为了探究活性化合物的作用机制，研究采用了基于双荧光素酶报告基因的微型基因组测定法。结果表明，2a对IAV聚合酶活性有强烈的抑制作用，其IC50为14.6 ± 1.3 μM，优于利巴韦林（40.8 ± 3.8 μM）。而嘧啶类似物5d和15b在高达400 μM的浓度下均未显示相关活性。这提示，尽管2a和5d在CPE测定中表现出相似的活性，但其作用机制可能不同。
7. 碳双环类似物在细胞内的三磷酸化
鉴于多数化合物的抗病毒活性在40 μM浓度下未超过50%，研究推测细胞活化（磷酸化代谢物形成）效率可能限制了其功效。通过LC-MS/MS监测细胞内代谢发现，1a、2a及其前药ProTide-1a均能有效形成其三磷酸代谢物TP-1a和TP-2a。尽管该骨架的伪C5′位是仲醇，存在空间位阻，但仍能被宿主细胞激酶有效识别和磷酸化，这凸显了该核糖模拟骨架在抗病毒药物开发中的实用性。
8. 计算机模拟提示通过锁定NTP结合位点抑制病毒聚合酶
使用AlphaFold 3进行的计算机模拟预测了TP-2a与IAV RdRp的结合模式。模型显示，与天然UTP相比，TP-2a结合在活性位点中，但其三磷酸基团的α-磷酸从催化中心位移，这可能会阻碍新生RNA C3′-氧的亲核攻击。这表明TP-2a可能通过非催化性地锁定NTP结合位点来抑制RNA合成。该模型与观察到的SAR数据一致：C5′/C6′羟基的灵活性可以被耐受，而旨在引起链终止的C3′修饰则无效，因为它们首先就无法有效掺入病毒RNA。
9. 三磷酸化类似物不抑制宿主DNA和RNA聚合酶
为评估潜在脱靶毒性，研究了TP-1a及其母体化合物1a对宿主聚合酶的影响。结果表明，在浓度高达50 μM时，TP-1a不抑制真核RNA聚合酶II和人线粒体RNA聚合酶。同样，在浓度高达100 μM时，TP-1a和1a也不抑制DNA聚合酶α、β和γ。结合细胞毒性筛选结果，这些数据支持了该骨架具有良好的安全性。
合成方法
研究建立了高效、通用的合成路线，能够以少于10步的步骤从关键中间体出发，合成多种嘧啶和嘌呤类碳双环核苷类似物。该合成策略的核心是通过Mitsunobu偶联、Stille偶联和随后的Diels-Alder反应构建碳双环核心骨架，然后进行后期官能化，实现结构多样化。尽管在伪C2′和C3′位置的修饰具有挑战性，但大多数类似物均可从尿苷型或腺苷型关键中间体衍生而来，证明了该合成路线的平台化潜力。
结论
本研究引入了一种新型碳双环核苷骨架，作为传统核糖结构的替代方案，展现出有前景的抗病毒化学型特征。关键发现包括：
- 1.
建立了稳健且多样化的合成平台，能够快速获取核苷类似物药物库。
- 2.
类似物2a对HCV、HSV和IAV表现出显著的抗病毒活性，并通过构效关系研究优化了结构。
- 3.
微型基因组测定证实2a的作用机制涉及直接或间接干扰IAV聚合酶。
- 4.
计算机模拟提示其可能通过锁定催化中心来抑制聚合酶。
- 5.
该骨架中拥挤的仲醇（伪C5′-OH）可在细胞内被高效磷酸化，无需前药策略。
- 6.
生成的三磷酸代谢物不是人类DNA/RNA聚合酶的底物，降低了脱靶毒性风险。
结果表明，与传统的核糖型对应物相比，碳双环骨架能显著改变所连接碱基的生物活性谱。虽然尿苷类似物2a具有抗病毒活性，但含有已知活性碱基（如莫努匹韦的NHC模板）的类似物却无活性，这凸显了新骨架对活性的关键影响。计算机模型提示，活性核苷类似物三磷酸基团的指向朝外，这可能阻碍其掺入病毒RNA。基于此模型，对伪C7′进行羟基化或操纵C8′-C9′双键是未来进行结构修饰的潜在方向。这项研究表明，具有快速合成通路的碳双环骨架可作为核糖型类似物的补充策略，为开发新药发现项目提供了理想的化学型。
